1研究背景和意义乳腺癌目前不仅是全球女性最常见的恶性肿瘤,也是女性死亡率中高居第二位肿瘤。近年来,乳腺癌也成为中国女性最普遍的恶性肿瘤,据统计,中国女性病例数占据了全球新发病例的12.2%和死亡率的9.6%。乳腺癌的治疗手段多样,主要包括手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗以及近几十年兴起的以曲妥珠单抗为主的靶向治疗。然而,尽管乳腺癌的综合治疗可以明显的降低其复发转移率和死亡率,可以延长患者无病生存时间(disease free survival,DFS)和总生存时间(Overall survival,OS),但某些特殊类型的乳腺癌的预后始终不够理想。乳腺癌在分子水平上是一种具有高度异质性的疾病,组织形态相近病理分型相同的肿瘤,其分子遗传改变却可能不同,从而导致肿瘤治疗和预后的不同。精准医疗时代来临,乳腺癌的分子分型为探讨肿瘤的异质性奠定了理论基础,如今也成为临床诊断和治疗的重要依据。乳腺癌的分子分型主要包括四类:腔面A型、腔面B型、HER-2过表达型和基底样型。基底样型乳腺癌(Basal-like breast cancer,BLBC)属于三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC),但表达基底型角蛋白。HER-2过表达型和基底样型乳腺癌预后较差,但因三阴性乳腺癌缺乏雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素受体(Progestrone receptor,PR)和HER-2靶点不能进行相应的内分泌治疗和靶向治疗而单纯依靠化疗,治疗效果欠佳,患者复发转移率高、无病生存期和总生存期短、预后差成为乳腺癌治疗的热点问题。由于这一亚型乳腺癌其内在基因分型、复发转移模式、优势治疗方案尚不明朗,且没有已知的治疗靶点,是近年来乳腺癌基础研究与临床实践的焦点与难点,至今未取得实质性突破。没有明确的治疗靶点,目前主要的全身治疗方案为化疗。然而并非所有的三阴性乳腺癌都对化疗敏感,那么对于化疗不敏感或易耐药人群就容易出现局部复发远处转移等不良事件而影响生存。随着肿瘤基因组学和蛋白组学的迅猛发展,乳腺癌这一领域的研究也越来越深入。肿瘤是一种遗传物质发生变异的疾病。某些病因损害了正常基因组或修饰状态,引发癌基因活化或抑癌基因失活,导致细胞增殖、分化和凋亡异常而形成肿瘤。2000年,Perou等开始研究乳腺癌的基因表达,作者通过对65份乳腺肿瘤患者标本8102个人类基因进行cDNA芯片检测后发现同一肿瘤的基因表达相对稳定,而不同肿瘤之间基因表达存在较大差异。因此他首先提出乳腺癌的四个亚型,随着研究不断深入,分子分型更加成熟更倾向临床,为乳腺癌的个体化治疗提供依据。RNA不仅是DNA和蛋白质的信使。整个真核生物的基因组转录过程中产生了大量的长链非编码RNA,提示了基因组表达和调节的复杂性。尽管目前人类对长链非编码RNA的了解尚不深入,它们以往通常被认为是基因转录中的“噪音”。长链非编码RNA(longnoncoding RNA,lncRNA)是由基因组中非编码序列转录生成的、长度大于200个碱基、不具备翻译成蛋白质能力的转录本。近年来,随着对长链非编码RNA的研究不断深入,大量实验表明由基因组中非编码序列转录生成的的长链非编码RNA在表观遗传水平、转录水平、翻译水平以及蛋白修饰过程中均可发挥重要的调控作用。然而,近几年来,功能性的LncRNA被不断发现,LncRNA也慢慢走入人们视线,例如和X染色体失活过程密切相关的XIST,与前列腺癌密切相关的PRNCR1和PCGEM1,在心血管发育过程中起重要作用的Braveheart以及和树突状细胞分化有关的lnc-DC等等。而且在肿瘤学领域,LncRNA成为了自microRNA之后另外一个研究热点。在乳腺癌中,LncRNA可以通过各种机制调控肿瘤细胞的生物学行为。研究发现,lncRNA-HOTAIR在乳腺癌转移过程中起重要作用,在乳腺癌原发肿瘤中HOTAIR高表达,而在转移肿瘤中相对更高表达,并且乳腺癌原发瘤中的HOTAIR表达水平与转移正相关,HOTAIR通过PRC2蛋白介导的表观遗传学变化来促进肿瘤转移,而下调HOTAIR的表达可以抑制肿瘤侵袭和转移。在乳腺癌中,lncRNA-FAL1的基因拷贝数的增加则提示较差的预后,lncRNA-FAL1通过调节BMI1结合到CDKN1A启动子调控CDKN1A转录,并且FAL1是通过抑制P21来发挥促进肿瘤形成、增殖和抑制衰老等作用的。lncRNA-BCAR4在三阴性乳腺癌中高表达,BCAR4可以和与它结合的蛋白SNIP 1和PNUTS相互作用,通过激活Hedgehog/GLI2信号通路来促进肿瘤细胞迁移。总体来说,目前已知的LncRNA具体调控的机制主要分为转录水平的调控(包括顺式调控和反式调控),翻译水平的调控,剪切调控以及其他转录后调控。lincRNA-RoR在三阴性乳腺癌原发及转移灶中高表达,并且可以和miR-145共同调控侵袭和转移。立足于长链非编码RNA目前在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色,但调控乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌的长链非编码RNA鲜有报道。以此为基石,寻找调控三阴性乳腺癌复发或者转移的关键机制,并且探索相关治疗靶点,最终有望在临床上为三阴性乳腺癌患者的靶向治疗提供理论基础。因此,本研究通过组织芯片的手段检测三阴性乳腺癌组织及癌旁组织中lncRNAs的表达,筛选出和TNBC预后相关并在肿瘤发生发展中可能发挥重要作用的差异lncRNAs,进行深入研究,全面、系统、深入地揭示lncRNAs在TNBC发生发展中所扮演的角色,为三阴性乳腺癌的诊断和治疗提供新的分子靶标。首先我们挑选经病理证实的三阴性乳腺癌患者术后标本165例以及配对的33例癌旁组织进行研究。将其制作成转录本芯片并检测长链非编码RNAs和信使RNAs(Messenger RNA,mRNA)的表达量。经过标准化数据处理后,通过比较癌与癌旁,我们发现肿瘤组织中长链非编码RNA的表达谱显著差异于癌旁组织,共筛选出183个差异mRNAs、195个差异lncRNAs,这些RNAs与肿瘤特异性和无复发生存期(recurrence-free survival,RFS)均相关。挑选出的对lncRNA再进行生物信息学分析。从mitransciptome(2015,NG)转录本数据库挑选出与乳腺癌相关lncRNAs,再从中挑选长度<2000bp,筛选出26对lncRNAs。然后用定量PCR对于以上的lncRNAs进行验证,从而找到3个序列正确的lncRNA。而其中有一个lncRNACAT1257在三阴性乳腺癌细胞系高表达,我们考虑这个lncRNA可能和三阴性乳腺癌的发生发展及预后密切相关,对其展开深入研究。之前也有研究表明长链非编码RNA可作为分子标志物预测乳腺癌病人的预后,甚至作为新的靶点来用于治疗乳腺肿瘤。由于lncRNA CAT1257之前从未被公开报道过,这个lncRNA的特征功能和在肿瘤中发挥的作用都无从得知,这个长链非编码RNA是否会是三阴性乳腺癌的分子标志物,能否提示对化疗耐药,以及是否会成为三阴性乳腺治疗的新靶点,都需要进一步深入的研究。2研究方法第一部分:三阴性乳腺癌组织与癌旁组织中长链非编码RNA的芯片检测和分析。TNBC组织芯片来源人群均为自2011-01-01至2012-12-31在上海市复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科诊断并手术的三阴性乳腺癌患者,均为女性,共165例。本院病理人员用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)方法判断ER、PR、HER-2表达,ER、PR阴性定义为:在有阳性内对照的情况下,<1%的肿瘤细胞核着色。HER-2阴性定义为:(-),(+),如果(++)则再行荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)检测,FISH 无扩增。年龄分布27-83,中位年龄55岁。入组的所有病人均签署了组织样本收集知情同意书,且病人组织的收集及使用均获得伦理委员会的批准。癌旁组织均取自于肿瘤边缘的5厘米外的相对正常组织并经病理检测确认无肿瘤。转录本芯片是由198个样本组成,包含165个三阴性乳腺癌组织和33对癌旁组织。用美国昂飞公司人类转录本(HTA2.0)基因芯片(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)。根据Affymetrix的标准操作流程,用生物素化的cDNA杂交HTA2.0芯片。杂交和冲洗后,用Affymetrix(?)GeneChip Command Console(AGCC)软件 GeneChip(?)Scanner 3000 7G扫描芯片。芯片制作和数据分析委托上海其明信息技术有限公司(Gminix)完成。之后是信使RNA和lncRNA的筛选:我们选择了差异表达mRNA(倍数变化>2 或<0.33 且错误发现率(false discovery rate,FDR)<0.001)。lncRNAs差异表达的阈值如下:倍数变化>1.5且FDR<0.001。通过结合RNA表达芯片数据和165位TNBC患者的随访数据,我们获得一组与无复发生存(RFS)相关的RNA。mRNA的挑选:P值小于0.1(log rank检验)认为有显著性差异,重复的mRNA被排除在外。lncRNAs的挑选:P值小于0.2(log rank检验)认为有显著性差异,与mRNA相比相关性不显著。另外,只有基因间lncRNAs才挑选在内。我们选择重叠的mRNAs和lncRNAs,共筛选出183个差异mRNA、195个差异lncRNA,这些RNAs与肿瘤特异性和RFS均相关。我们将挑选好的LncRNA进行生物信息学分析。从mitransciptome(2015,NG)网站http://www.mitranscriptome.org挑选出与乳腺癌相关lncRNA,并从中挑选长度<2000bp且在乳腺细胞表达,共筛选出26个lncRNA。第二部分:长链非编码RNA CAT1257的特征和功能试验:1)候选lncRNA的筛选:我们用Real-Time PCR验证发现共3个lncRNA癌与癌旁表达情况与原芯片结果一致;2)定量PCR检测lncRNA-CAT1257.1/CAT1257.1在乳腺癌细胞中的表达情况,其中只有lncRNA CAT 1257在三阴性乳腺癌中特异性表达;3)构建RNA干扰pLKO.1载体:4)慢病毒包装:传代生长状态良好的293FT细胞,培养18-24小时后进行共转染,培养48小时后收集含病毒的上清;5)pLVTHM可诱导型慢病毒载体的构建;6)pLenti6.2-tTR-KRAB载体构建;7)pLVTHM-mCherry-shRNA lncRNA CAT1257 诱导稳定细胞系构建;8)PCDH-lncRNA CAT1257过表达细胞系的构建;9)CCK8实验探索lncRNA CAT1257对三阴性乳腺癌细胞系增殖的影响。第三部分:lncRNACAT1257的作用机制,相互作用蛋白的研究:1)RACE实验所用RNA提取;2)RNA添加PolyA尾;3)RACE获得模板(1st cDNA合成)4)RACE所需长引物设计;5)RACE扩增钓取目的lncRNA全长;6)TA克隆鉴定回收产物及连接T载体;7)lncRNACAT1257全长确定与克隆;8)Triple SILAC培养MDA-MB-231细胞系;9)DNA质粒线性化处理;10)Tris饱和酚提取线性DNA质粒;11)T7体外转录(NEB:HiScribeTM T7 High Yield RNA Synthesis Kit);12)RNA 初步纯化Phenol-chloroform Extraction and Ethanol Precipitation(去除蛋白组和酶组分);13)RNA进一步纯化(去除小分子RNA和 DNA);14)RNA 浓缩过程(方便 RNA 标记);15)RNA-Biotin 标记(PierceTM RNA 3’ End Biotinylation Kit);16)RNA复性;17)Biotin-RNA 与 Beads 结合;18)细胞蛋白样品裂解(全蛋白提取);19)蛋白样品RNP封闭;20)RNA-PROTEIN Binding 实验;21)RIP(RNA 免疫沉淀)3研究结果第一部分:三阴性乳腺癌组织与癌旁组织中长链非编码RNA的芯片检测和分析。我们挑选经病理证实的三阴性乳腺癌患者术后标本165例以及配对的33例癌旁组织进行研究。将其制作成转录本芯片并检测长链非编码RNA和信使RNA(Messenger RNA,mRNA)的表达量。经过标准化数据处理后,通过比较癌与癌旁,我们发现肿瘤组织中长链非编码RNA的表达谱显著差异于癌旁组织,共筛选出183个差异mRNAs、195个差异lncRNAs,这些RNAs与肿瘤特异性和无复发生存期(recurrence-free survival,RFS)均相关。从mitransciptome转录本数据库挑选出与乳腺癌相关lncRNAs,再从中挑选长度<2000bp,共筛选出 26 个 lncRNAs。第二部分:长链非编码RNA CAT1257的特征对乳腺癌细胞生长、转移中的作用。1)lncRNA CAT1257.1在三阴性乳腺癌中高表达:根据RNA-seq数据(图1),CAT1257.1相对于正常组织,乳腺癌中高表达。同时,其他癌组织与癌旁组织中,也观察到癌比正常组织高表达的情况,所以CAT 1257可能是一个广谱的癌高表达lncRNA。我们针对26个潜在的Mitranscritome与HTA 2.0芯片交集设计引物,发现其中3个引物对能扩增到目的长度的序列,其中lncRNA CAT 1257(编号为TN9B)样品信号比较强。设计的定量PCR引物跑电泳以后,发现基本只存在CAT1257.1这个产物的存在,而无CAT1257.2转录本的存在。利用该定量PCR引物检测各个乳腺细胞系的表达水平,发现正常和非三阴性乳腺癌都低表达,而TNBC细胞系以及两株MDA-MB-231衍生的高转移细胞系都存在高表达。说明lncRNA CAT1257可能是一个潜在的三阴乳腺癌特异性高表达的lncRNA。选择重叠区域的25bp长度的探针,如有则将这些符合的探针重新注释成一个新的探针集,重注释(re-annotation)的方法为生物信息学程序分析(Bioinformatics Programmer Analyst),在33例癌与癌旁组织中分析该lncRNA的表达情况,结果发现在33对癌与癌旁中,癌比癌旁平均表达高1.2倍,没有存在特别显著的差别。但通过定量PCR检测其中7对癌与癌旁组织,发现癌比癌旁存在明显的差异倍数2)下调lncRNA CAT1257强烈抑制细胞增殖。我们将构建的pLKO.1-shRNA lncRNA CAT1257,包装成慢病毒感染MDA-MB-231后提取RNA反转录成cDNA,定量PCR检测4个shRNA靶点的干扰效率,shRNA-A和shRNA-C干扰效率最高,重新分别命名为shRNA1和shRNA2,两者干扰后,细胞增殖存在明显影响。第三部分:lncRNACAT1257的作用机制,相互作用蛋白。1)RACE获得lncRNA CAT1257 全长:通过从 MDA-MB-231 和 MCF10A 细胞提取的 RNA,通过 SMARTer RACE cDNA amplification 中获得 5’RACE 和 3’RACE 产物电泳。为获得了目的序列,我们在设计5’RACE和3’RACE的引物时,分别都设计了2套RACE引物(2套引物的第二轮Nest PCR引物相同),结果3’RACE结果只有第一套引物存在产物,而且其产物条带比较单一,克隆测序鉴定后就是目的序列,而第二套引物无任何产物。5’RACE扩增的条带结果比较复杂,两套引物获得了两种产物,对于5’RACE获得的两种产物进行序列比对显示,5’RACE中长片段产物相对于短片段产物,两者的关系是,长片段产物包含了短片段产物,同时,短片段产物的含量比较弱所以,暂定5’RACE的产物为长片段产物。根据5’RACE的产物为长片段产物与3’RACE产物,拼接成理论的全长,为1730bp全长的序列,根据此序列,我们设计了 1对尽量能扩增全长序列的 PCR引物(F:ATTACCTGTGATTTCAAGTGGG,R:CAGCTACAATAAATGTCAAGTCCTT),利用该引物对,在 5’RACE 的 cDNA模板进行Touch Down PCR扩增,扩增产物电泳出现一个目的条带,测序鉴定确实是lncRNA CAT1257。该序列的全长序列为:>FULL LENGTH by Amplification from cDNA library(1730bp)。2)用 RNA PULL DOWN 结合 SILAC方法鉴定lncRNA CAT1257相互作用蛋白。SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC),其基本原理是分别采用含有轻、中和重型同位素必需氨基酸的培养基培养细胞(本实验用Lys和Arg白标记,适合于胰蛋白酶消化蛋白肽段),新合成的蛋白质即嵌合了同位素氨基酸,如此培养5-7代后,细胞的所有蛋白质均被同位素标记上。经过不同实验目的的处理(本实验室是平行标记MDA-MB-231细胞),等量混合各类型蛋白质,然后经SDS-PAGE分离和质谱分析,通过比较一级质谱图中同位素峰型的面积大小进行相对定量,同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。通过LTQ-orbitrap鉴定SILAC-RNA PULL DOWN鉴定lncRNA CAT1257鉴定所得候选蛋白信息,初步筛选入选标准:intensity>200000,只在sense中存在信号(H),antisense(M)和空磁珠(L)都不存在可检测的信号。这些蛋白中包括广泛存在的RBP蛋白,如HNRNPL,PCBP2等。本实验选择若干与乳腺癌相关的若干蛋白进行候选验证。选择了 5个候选蛋白进行后续RIP验证,选择此5个蛋白的理由是PTGLAB公司上存在IP级抗体的5个蛋白。RNA免疫沉淀样品,用半定量PCR检测CAPRIN1与lncRNACAT1257存在相互作用,其他蛋白则没有检测明显的信号。发现CAPRIN1(cytoplasmic activation/proliferation-associated protein-1)是该 lncRNA 的相互作用蛋白。CAPRIN1已知在70%以上的乳腺癌组织中存在高表达,与肿瘤的增殖密切相关,近来年成为肿瘤治疗的靶点研究之一。4讨论与结论长链非编码RNA在乳腺癌和三阴性乳腺癌的研究报道较少。我们采用了联合三阴性乳腺组织芯片和转录本数据库mitransciptome分析的方法来筛选和三阴性乳腺癌有关的lncRNA。目前常用的方法就是通过分析有共表达关系的信使RNA的功能。本部分研究中,我们利用芯片同时检测三阴性乳腺癌组织和癌旁组织中长链非编码RNA和信使RNA的表达量,共筛选出与肿瘤特异性和RFS均相关的183个差异mRNA、195个差异lncRNA。这些RNAs这为长链非编码RNA在三阴性乳腺癌中的功能研究提供了丰富的数据源,具有重要的参考价值。为了更精确找到的乳腺肿瘤相关的lncRNA,我们通过“基因间(Intergenic)”“lncRNA”“乳腺(breast)”“肿瘤(cancer)”类型进行筛选,最后找到26个长链非编码RNA。这也为最后筛选到目标lncRNA缩小了范围,节约了成本。根据RNA-seq数据CAT1257.1相对于正常组织,乳腺癌中高表达。同时,其他癌组织与癌旁组织中,也观察到癌比正常组织高表达的情况,所以CAT 1257可能是一个广谱的癌高表达lncRNA。设计的定量PCR引物跑电泳以后,发现基本只存在CAT1257.1这个产物的存在,而无CAT1257.2转录本的存在。利用该定量PCR引物检测各个乳腺细胞系的表达水平,发现正常和非三阴性乳腺癌都低表达,而TNBC细胞系以及两株MDA-MB-231衍生的高转移细胞系都存在高表达。说明lncRNA CAT1257可能是一个潜在的三阴乳腺癌特异性高表达的lncRNA。我们将构建的pLKO.1-shRNA lncRNA CAT1257,包装成慢病毒感染MDA-MB-231后提取RNA反转录成cDNA,定量PCR检测4个shRNA靶点的干扰效率,shRNA-A和shRNA-C干扰效率最高,重新分别命名为shRNA1和shRNA2,两者干扰后,细胞增殖存在明显影响。其具体机制需要进一步研究。RNA PULL DOWN技术是研究RNA相互作用蛋白的最常用的技术。最简单的 RNA PULL DOWN 是采用 Biotin RNA Labeling Mix(Roche)和 T7 RNA 体外转录试剂盒,进行RNA体外转录过程随机掺入Biotin-UTP,从而获得带Biotin标记的RNA样品,可直接用于RNA PULL DOWN实验。但该产物全长中随机存在的Biotin可能会影响RNA的高级结构。所以,我们舍弃了 RNA序列中随机标记的技术,而采用了 RNA3’末端标记来进行研究,利用T4RNA连接酶将Biotin标记的胞苷二磷酸连接到单链RNA的3’端。3’端的末端标记不干扰RNA结构,因此,比标记核苷酸的随机掺入更加理想。lncRNA相互作用蛋白的富集过程经过优化,相当简单。首先将RNA与链霉亲和素磁珠结合。之后在蛋白质-RNA结合缓冲液中平衡RNA结合的磁珠,再加入蛋白裂解液。随后添加适当的缓冲液、涡旋振荡,并在磁力架上分离,洗涤磁珠。最后样品可通过非变性的生物素洗脱缓冲液或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱,用于下游分析。RNA3’末端标记虽然避免了很多假阳性的结合蛋白,但直接用SDS-PAGE样品洗脱,容易获得大量非特异性结合蛋白(如磁珠结合蛋白等),高丰度的非特异性蛋白容易干扰真正lncRNA相互作用蛋白。因此,我们在进行RNA PULL DOWN实验中引入了 SILAC定量蛋白组血技术。存在的5个候选蛋白进行后续RIP验证,选择此5个蛋白的理由是PTGLAB公司上存在IP级抗体的5个蛋白。RNA免疫沉淀样品,用半定量PCR检测CAPRIN1与lncRNA CAT1257存在相互作用,其他蛋白则没有检测明显的信号。CAPRIN1是该lncRNA的相互作用蛋白。CAPRIN1已知在70%以上的乳腺癌组织中存在高表达,与肿瘤的增殖密切相关,近来年成为肿瘤治疗的靶点研究之一。具体lncRNA CAT1257与其相互作用蛋白CAPRIN1之间的关系还在进一步研究中。结论:1)我们采用了联合三阴性乳腺组织芯片和转录本数据库mitransciptome分析的方法来筛选和三阴性乳腺癌有关的lncRNAs;2)发现lncRNACAT1257在三阴性乳腺癌中特异性表达;3)敲除三阴性乳腺癌细胞的lncRNACAT1257 后,细胞增殖明显抑制;4)发现 CAPRIN1 是 lncRNA CAT1257的相互作用蛋白。