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广州管圆线虫病(Angiostrongyliasis)是由广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)感染而引起的。作为一种新发的食源性传染性疾病,广州管圆线虫病在全球的流行都呈现出上升的趋势,对人类的威胁也越来越大。传统的广州管圆线虫检测对检测者的形态学知识背景要求高,且幼虫期形态很小,不易辨别。因此,建立一种操作简单、快速、灵敏度高的广州管圆线虫检测方法对广州管圆线虫病的防控很重要。
本文采用通用引物成功克隆了广州管圆线虫的rDNA ITS序列(包括部分18S,ITS1,5.8S,ITS2和部分28S序列)和mtDNACOX1基因序列,并对这两个序列分别进行分析。结果显示,ITS-2和COX1基因序列作为物种鉴定的靶标基因都有很强的可靠性。
针对广州管圆线虫的ITS-2区设计了特异引物,建立了快速检测广州管圆线虫成虫的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测体系。构建了广州管圆线虫成虫荧光定量PCR的标准曲线,并做了特异性、灵敏性和重复性试验。结果表明构建的荧光定量PCR检测方法比常规PCR检测更快,灵敏度更高,且实现了定量。另外,针对广州管圆线虫成虫ITS-2区设计了特异引物及TaqMan探针用于荧光定量PCR,建立了粪源性广州管圆线虫Ⅰ期幼虫TaqMan荧光定量PCR的原位检测体系。荧光定量PCR能在每粒鼠粪中含1条Ⅰ期幼虫的条件下能准确检测出,对放置长达12个月的阳性粪便也能检出病原的DNA。本研究将荧光定量PCR技术应用到广州管圆线虫病病原线虫的检测,为医学检验及进一步了解广州管圆线虫病的流行病学特点并最终达到有效控制提供了技术支持。
应用EST策略,我们从广州管圆线虫成虫的cDNA文库中克隆了热休克蛋白70(HSP70)的全长cDNA序列,并己在GenBank中登录(登录号为:HM017959),根据基因编码序列,克隆至表达载体pET32a(+),转化至大肠埃希菌BL21(DE3)株,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用梯度尿素洗涤重组蛋白,并用割胶法纯化重组蛋白,佐剂乳化后皮下注射小白鼠,获得抗血清。用Real time-PCR技术,对HSP70基因在不同胁迫条件下的表达情况进行了检测。结果表明:38℃高温胁迫下,2h时表达量达到最高峰,为对照样品的5.34倍。4℃低温胁迫下,0.5h检测到HSP70的表达量下降至最低点,为对照样品的0.25倍。紫外胁迫下(波长253.7nm),2min后HSP70的表达量快速上升至最高峰,为对照样品的2.22倍,随后表达量迅速下降。因此推测,HSP70基因在广州管圆线虫抵抗高温、低温和紫外三种胁迫方面都可能具有重要作用。