【摘 要】
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枇杷（Eriobotrya japonical Lindl.）是蔷薇科枇杷属（Eriobotrya）植物,原产于我国南方的一种常绿的果树。但枇杷种子多且大,可食率低;此外,枇杷本身对光能的利用效率不高,还易受高温和低温的抑制,尤其是冬季低温时,正是枇杷开花和幼果形成阶段,较低的光合效率严重影响产量和品质。光合作用对温度特别敏感,尤其是光系统II（PSII）。低温胁迫下,植物光系统易发生光抑制现象,
【基金项目】
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国家重点研发计划资助（编号:2019YFD1000900）； 重庆市高校创新研究群体项目资助（项目编号CXQT19005）； 中央高校基本业务费专项资金项目（项目编号:XDJK2019AA001和XDJK2020B058）；
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枇杷（Eriobotrya japonical Lindl.）是蔷薇科枇杷属（Eriobotrya）植物,原产于我国南方的一种常绿的果树。但枇杷种子多且大,可食率低;此外,枇杷本身对光能的利用效率不高,还易受高温和低温的抑制,尤其是冬季低温时,正是枇杷开花和幼果形成阶段,较低的光合效率严重影响产量和品质。光合作用对温度特别敏感,尤其是光系统II（PSII）。低温胁迫下,植物光系统易发生光抑制现象,针对这一现象演化出了多种响应机制,而捕光蛋白在其中发挥着至关重要的作用。本研究在已有基础上,以二倍体（GZ23）和四倍体亲本（B431）,及其三倍体F1代为实验材料,从枇杷中克隆EjLhcb4.1/5/6基因,并进行生物信息学分析;同时利用q RT-PCR分析光合途径中抗逆相关基因在不同倍性枇杷中的表达特性;构建含有绿色荧光蛋白的瞬时表达载体进行三个蛋白的亚细胞定位;构建超表达载体转化拟南芥观察转基因植株表型变化;构建酵母双杂载体观察捕光蛋白与修复蛋白间的相互作用。以期明确EjLhcb4.1/5/6基因在转基因拟南芥中的生物功能,进而解析基因在调控枇杷抗冻高光效性状中的功能。其主要研究结果如下:1.低温对不同倍性枇杷生理活性的影响。低温胁迫条件下,三倍体枇杷F1代的光合酶与抗氧化酶活性以及体内糖含量相较于其亲本二倍体较高,而与四倍体亲本差异不显著。在低温处理条件下,枇杷光合酶FBA活性迅速升高;抗氧化酶活性在0℃时增强,其中POD酶以及APX酶活性随着温度降低呈现下降的趋势;Rubisco酶活性则随着温度的降低,表达活性上升。通过高效液相色谱测定枇杷叶片中葡萄糖、果糖与蔗糖的含量,结果显示叶片中糖含量先升高,而随着温度进一步降低,糖含量也随之下降;此外,三倍体枇杷叶片中糖含量较其他倍性显著升高。这说明了低温影响到了植物光合作用进程中的暗反应碳固定过程,三倍体枇杷的光合作用进程受低温影响较小。2.生物信息学分析。从枇杷中克隆得到微量捕光蛋白三个基因,命名为EjLhcb4.1,EjLhcb5,EjLhcb6。EjLhcb4.1包含一个全长为874bp的开放阅读框,编码290个氨基酸残基,推测分子量为31.66k D;EjLhcb5的开放阅读框全长为871bp,编码289个氨基酸残基,推测分子量为30.99k D;EjLhcb6的开放阅读框全长为775bp,编码257个氨基酸残基,推测其分子量为37.39k D。根据同源序列比较与进化分析显示,枇杷中的Lhcb4.1蛋白与栎树具有较高同源性,Lhcb5与欧洲甜樱桃间同源性最高,Lhcb6蛋白与苹果间同源性最高,且Lhcb5和Lhcb6蛋白与拟南芥间单独分化。3.EjLhcb4.1/5/6的亚细胞定位。利用生物信息学分析软件分析得到EjLhcb4.1/5/6均定位于叶绿体中。构建p CAMBIA1300-35S-EjLhcb4.1/5/6-GFP。瞬时表达融合蛋白转入烟草中,并通过荧光显微镜观察发现激发的绿色荧光和叶绿素的红色自发荧光完全重合,说明这三个蛋白定位于叶绿体中。4.EjLhcb4.1/5/6与修复蛋白Psb S的相互作用。构建了p GADT7-EjLhcb4.1/5/6与p GBKT7-Psb S载体,利用酵母双杂交互作实验发现,在低温下Psb S与EjLhcb4.1间存在着相互作用,这说明捕光蛋白与Psb S对PSII的修复相关;但研究未发现Psb S与EjLhcb5/6间的相互作用,二者与Psb S间的相关性仍需要进一步验证。5.EjLhcb4.1/5/6在转基因拟南芥中的功能。构建了p FGC5941-35S-EjLhcb4.1/5/6植物表达载体并转化拟南芥,转基因拟南芥生长情况良好。低温处理下,转基因拟南芥相较于野生型拟南芥萎蔫程度较低,并且在25℃环境下培养一段时间后能快速恢复正常的生理形态。其存活率和生长量要显著高于野生型。转基因拟南芥的光系统II最大光化学效率（Fv/Fm）较高,电导率（REL）显著上升,捕光蛋白基因表达量升高;这些生理因素均表明,低温胁迫下,EjLhcb4.1/5/6使拟南芥转基因植株避免了光损伤,且光抑制的发生并未明显影响其光合产量,这对维持光合系统稳定性发挥了重要作用。综上表明,EjLhcb4.1/5/6具有增强三倍体枇杷F1代低温耐受性且维持低温胁迫下光合作用稳定性的生物功能。但在不同倍性枇杷中的表达变化模式及调控机制尚有待进一步研究。
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