【摘 要】
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性别决定和性腺发育广泛存在于动物体中,这对于有性繁殖物种的生存和繁衍至关重要。调控性别决定和性腺发育的机制涉及到复杂的基因调控网络。探究高度多样化的调控系统是如何保证和实现生殖系统健康和遗传物质成功传递的,对于我们解析性腺发育以及性别决定具有重要意义。斑马鱼与哺乳动物相比,具有高度相似的基因组水平,且组织器官发育的调控机制也具有一定保守性,因此斑马鱼成为研究血液细胞发育、神经系统发育、器官再生和疾
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性别决定和性腺发育广泛存在于动物体中,这对于有性繁殖物种的生存和繁衍至关重要。调控性别决定和性腺发育的机制涉及到复杂的基因调控网络。探究高度多样化的调控系统是如何保证和实现生殖系统健康和遗传物质成功传递的,对于我们解析性腺发育以及性别决定具有重要意义。斑马鱼与哺乳动物相比,具有高度相似的基因组水平,且组织器官发育的调控机制也具有一定保守性,因此斑马鱼成为研究血液细胞发育、神经系统发育、器官再生和疾病模型的理想模式生物。但迄今为止,斑马鱼性腺发育领域的研究还不够全面,部分原因是由于斑马鱼缺少性染色体,其性腺发育由多个基因共同调控,性别决定这一过程受到诸如水温、密度等环境因素的影响。近年来,斑马鱼中广泛应用的基因编辑技术（TALEN和CRISPR/Cas9等）和单细胞RNA-seq技术为解决这个问题提供了可能。斑马鱼RNA结合蛋白46（Rbm46）属于核内不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hn RNP）R/Q家族,包含两个RNA识别基序（RNA Recognition Motifs,RRMs）,一个退化的RRM和一个C端双链RNA结合基序（Double-Stranded RNA Binding Motif,DND1-DSRM）结构域,到目前为止关于rbm46在体内的表达和功能研究还鲜有报道。在本研究中,我们首先通过RT-PCR确定了rbm46的转录本存在母源性表达,且两个转录本rbm46-201和rbm46-202在斑马鱼性腺中特异表达。我们根据最新的基因组组装结果,发现两个转录本均包含六个外显子,位于第一号染色体的同一基因座位置。通过整体原位杂交和切片原位杂交证实rbm46在发育中的性腺中高表达。为了研究rbm46在性腺发育中的功能,我们利用TALEN技术成功构建并筛选得到两个rbm46突变品系,分别于rbm46第3号外显子缺失11和16个bp,命名为rbm46△11/△11和rbm46△16/△16。两个突变品系均为终止密码子提前引入,分别终止于第55和51号氨基酸处,且两突变品系均可以正常存活。通过组织学和解剖学观察发现,rbm46-/-纯合突变系全部为雄性,且无法和野生型雌鱼自由交配产生后代。我们将tp53突变引入rbm46-/-突变系获得rbm46/tp53双突变品系,发现不能挽救rbm46突变系全雄的表型,说明这种表型的发生不是由经典的tp53介导的斑马鱼性腺分化机制调控的。接下来我们通过Western Blot和免疫荧光实验发现,在性别决定的关键时期,rbm46-/-突变体中减数分裂进程严重受损,其中联会复合体蛋白3（sycp3）在rbm46-/-突变体中不表达,减数分裂所需的关键酶也被显著下调,由此我们推测突变体之所以全雄不可育是因为rbm46基因的缺失引起了与减数分裂相关的关键因子受损,造成减数分裂异常。为了探究rbm46-/-突变体全部发育为雄性且精巢组织无法成功进行减数分裂产生功能性精子的内在原因,我们进行了早期生殖细胞的增殖和凋亡水平检测,结果显示rbm46-/-突变体中的早期生殖细胞增殖和凋亡正常。hn RNP家族成员hn RNP C的功能与m RNA的剪接和稳定性密切相关,随后,我们通过Western Blot检测发现hn RNP C的表达量在突变体中显著升高,这提示我们rbm46突变体中m RNA的剪接可能会受到损坏。为了筛选出rbm46基因缺失引起的关键受损因子,我们选择斑马鱼性别决定早期即30dpf为时间点,进行全长转录组测序,我们发现在突变体组中的选择性剪接事件和野生型相比发生了明显变化。IGV软件分析得到一些重要的与性腺发育相关功能基因发生了异常剪接,如DAZ家族成员dazl、DEAD-box解旋酶ddx5、细胞色素450家族成员cyp11a1和cyp19a1a、多能干细胞标记pou5f3、剪接相关基因rbm5和rbm10。同时,我们通过RT-PCR和q RT-PCR证实了上述多个与斑马鱼性别决定、减数分裂以及多能干细胞分化相关的关键基因发生的异常剪接本。我们对异常的基因剪接本进行分子克隆和体外细胞转染实验,结果表明这些异常的剪接体多数都出现翻译错误。由此,我们推测在正常机体中,rbm46在调控性腺发育相关基因的m RNA正常剪接过程中,扮演着重要的“指导”角色。总之,我们的研究表明,在斑马鱼中缺失rbm46会导致其性腺生殖细胞分化异常,并且这种异常可能是由于与斑马鱼性别决定、减数分裂以及干细胞分化相关的关键基因选择性剪接失控所导致的。更为重要的是,人类RBM46在睾丸组织中高表达,但其是否参与睾丸发育过程未见报道,这意味着我们的研究不仅可以丰富斑马鱼的性别决定调控网络,也可为人类或其他哺乳动物的生殖系统发育研究提供一定的参考。
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