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Hedgehog（Hh）信号通路在胚胎发育、器官发生中具有重要作用,由配体Hh、共受体Patched（Ptch）和Smoothened（Smo）、转录因子Gliotactin1-3（Gli1-3）组成。在脊椎动物中,Hh包括Desert hedgehog（Dhh）、Indian hedgehog（Ihh）和Sonic hedgehog（Shh）,Ptch包括Pcth1和Ptch2。已有研究表明,在哺乳类,Hh信号通路在性腺多种细胞如生殖细胞、Leydig细胞（Leydig cells,LC）分化发育中具有重要作用。在鱼类,Hh信号通路目前主要在斑马鱼（Danio rerio）胚胎发育过程以及其它组织中进行了研究,但其在性腺细胞中的功能如何,目前未见报道。另一方面,Leydig干细胞（Stem Leydig cells,SLC）的增殖与分化直接影响雄激素主要产生细胞LC的正常发生;然而,SLC增殖与分化的调控机制在哺乳类目前知之甚少,在鱼类,几乎尚属空白。已有研究证实,Hh通路受体Smo激动剂在哺乳类SLC增殖与分化中具有重要作用,但其在鱼类SLC中的作用如何,尚不清楚。罗非鱼（本文中如果没有特别说明均指尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus））为世界性养殖鱼类,属于鲈形目,丽鱼科,拥有生长速度快、抗病能力和适应性强、成熟时间和产卵周期短等优点,是鱼类生殖生理研究的良好模型。特别重要的是,本实验室前期从3月龄罗非鱼精巢中成功建立了迄今鱼类唯一SLC细胞系（TSL）。该细胞系目前已培养90代以上,依然能够稳定增殖;用含罗非鱼精巢提取物、人绒毛膜促性腺激素的培养基进行诱导,可表达多种性类固醇合成相关蛋白和酶类如Star1、Star2、Cyp17a2、Cyp11b2,并产生11-酮基睾酮（11-ketotestosterone,11-KT,鱼类主要雄激素）。迄今,罗非鱼Hh信号通路成员表达模式及其在性腺不同细胞（特别是SLC）中的作用如何,未见报道。鉴于此,本研究一方面分离鉴定了罗非鱼Hh信号通路成员,对其表达模式和在性腺不同细胞增殖和存活中的作用进行了研究;另一方面,研究了Hh通路活化受体Smo在TSL及体外培养精巢组织中SLC增殖和分化中的作用和机制。具体结果如下:1.罗非鱼Hh信号通路成员的鉴定及在性腺不同细胞中的作用（1）c DNA克隆与序列分析采用生物信息学分析和RT-PCR,成功获得罗非鱼dhh、ptch1、ptch2和smo完全开放阅读框的c DNA序列,分别编码458、1551、1491和825个氨基酸。蛋白结构、系统进化树和基因共线性分析结果均表明,罗非鱼Dhh、Ptch1、Ptch2和Smo均为哺乳类直系同源分子。（2）m RNA表达模式RT-PCR结果显示,dhh、ptch1、ptch2和smo在性腺中均有表达。荧光原位杂交结果显示,在精巢生殖细胞中,dhh、ptch1、ptch2和smo在除精子外的各级生殖细胞均有表达,在精巢体细胞中,dhh主要在支持细胞（Sertoli cells,SC）表达,ptch1、ptch2和smo在LC和SC中均有表达;在卵巢生殖细胞中,dhh主要在卵原细胞中表达,ptch1、ptch2和smo在除IV时相卵母细胞外的各级生殖细胞均有表达;在卵巢体细胞中,dhh、ptch1和ptch2在所有体细胞中均有表达,smo只在颗粒细胞中表达。提示,Hh信号通路在罗非鱼精巢、卵巢不同细胞分化发育过程中具有作用。（3）在性腺不同细胞中的作用在精巢组织和卵巢组织的体外培养体系中,通过Ed U掺入法和TUNEL法分别检测经Smo激动剂（SAG）或抑制剂（cyclopamine）处理后性腺不同细胞即生殖细胞、体细胞增殖活性及其凋亡情况。结果显示,SAG显著促进精巢生殖细胞的增殖（p＜0.01）,cyclopamine显著促进精巢LC和SC发生凋亡（p＜0.01）;SAG和cyclopamine处理对卵巢生殖细胞和体细胞的增殖与凋亡均未见明显影响（p＞0.05）。从而表明,Hh通路在精巢生殖细胞的增殖及LC和SC的存活中具有重要作用。2.Smo在罗非鱼SLC增殖和分化中的作用（1）Smo在SLC增殖和存活中的作用RT-PCR检测到smo在TSL中有表达。通过显微观察和细胞计数检测Smo在SLC增殖和存活中的作用。结果显示,与对照组相比,SAG可显著促进TSL增殖（p＜0.01）,用cyclopamine处理TSL,可诱导细胞几乎全部发生凋亡。从而表明,Smo在罗非鱼SLC增殖和存活中具有重要作用。（2）Smo在SLC分化中的作用通过检测SAG诱导TSL分化为成熟LC的能力以及SAG促进体外培养精巢组织中SLC分化能力,以研究Smo在SLC分化过程中的作用。结果显示,用含SAG的培养基处理TSL 28 d后,细胞表达Star2、Cyp11b2,并产生11-KT,而对照组细胞未检测到Star2、Cyp11b2的表达及11-KT的产生;用二甲磺基乙烷（Ethylene dimethanesulfonate,EDS）处理体外培养的精巢组织以消除其内源性LC,然后用含或不含SAG的培养基继续培养,结果显示,在培养的第14 d,SAG处理组培养上清11-KT的水平达到58 pg/m L,而对照组未能检测到11-KT的产生。从而表明,Smo可以促进罗非鱼SLC的分化。（3）Smo介导SLC增殖和分化的机制通过用Hh信号通路通用转录因子Gli1、Gli2抑制剂处理TSL及体外培养精巢组织,以鉴定Smo介导SLC增殖与分化的下游信号分子及靶基因。一方面,在含SAG的培养基中添加Gli1抑制剂（GANT58）或Gli1/2抑制剂（GANT61）,以处理TSL,结果显示,仅GANT61几乎诱导TSL全部发生凋亡（p＜0.01）,GANT58处理组细胞仅显著少于SAG组（p＜0.01）,Smo可能通过Gli1/2介导TSL增殖与分化。进一步用EDS消除体外培养精巢组织内源性LC,然后用含SAG和GANT61的培养基同时处理精巢组织,结果显示,GANT61抑制精巢组织11-KT的产生。此外,SAG处理TSL 48 h后,q PCR检测gli1和gli2的表达变化情况,结果显示,与对照相比,gli1表达显著上调（p＜0.05）,gli2表达没有明显变化（p＞0.05）。综上,Smo可能通过Gli1/2介导了SLC的增殖与分化,并且gli1是其作用的下游靶基因。本研究率先在硬骨鱼类中证实Hh信号通路在精巢生殖细胞增殖和体细胞存活中具有重要作用,并且对其通路活化受体Smo在SLC中的作用和机制进行了研究。该研究不仅丰富了我们对于Hh信号通路在硬骨鱼类性腺不同细胞中作用的深入认识,而且促进了我们对SLC增殖与分化调控机理的深入理解,可为鱼类雄激素水平调控提供新思路,同时也可为由LC发育障碍引起的雄激素缺乏相关疾病治疗提供参考。