论文部分内容阅读
目的:基于肾小球足细胞凋亡损伤导致蛋白尿机制,探讨黄芪桂枝五物汤减轻IgA肾病小鼠蛋白尿的作用机制。 方法:选取SPF级雄性BALB/c小鼠120只,采用口服BSA+尾静脉注射SEB法制作IgA肾病模型。根据体重随机将小鼠分为正常组、模型组、黄芪桂枝五物汤组低剂量组、黄芪桂枝五物汤组中剂量组、黄芪桂枝五物汤组高剂量组、缬沙坦组,每组20只。对小鼠一般状况进行观察、全自动生化分析仪测定24小时尿蛋白定量、肝肾功能指标。肾组织病理学检测:免疫荧光检测IgA,光镜观察HE、PAS、PASM、Masson染色,电镜下观察肾组织病理超微结构。免疫荧光定位Nephrin、Podocin、TNF-α、TNFR1、Caspase-8和Caspase-3在肾脏内表达部位,RT-PCR检测Nephrin、Podocin、TNF-α、TNFR1、Caspase-8和Caspase-3基因表达量变化,Western Blotting检测Nephrin、Podocin、TNF-α、TNFR1、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达量变化。TUNEL法染色检测肾小球内细胞凋亡率及凋亡荧光强度。免疫荧光双重标记定位足细胞标记蛋白Nephrin与凋亡活化蛋白Cleaved Caspase-3表达部位及荧光强度检测。 结果:与正常对照组相比,模型组小鼠一般状态差,体重降低明显,24小时尿蛋白定量、血清肌酐、尿酸升高明显,血清白蛋白降低明显;与模型组相比,黄芪桂枝五物汤组小鼠一般状态较好,体重升高明显,24小时尿蛋白定量、肌酐、尿酸降低明显,血清白蛋白升高明显,缬沙坦小鼠一般状态无明显改善,体重未见升高,24小时尿蛋白定量降低明显,血清肌酐、尿酸升高明显,血清白蛋白无明显改善。免疫荧光检测IgA荧光强度,与正常对照组比较,模型组及各治疗组较正常对照组升高明显;与模型组比较,黄芪桂枝五物汤中、高剂量组降低明显,缬沙坦组无明显改变。RT-PCR检测:与正常对照组比较,模型组Podocin、Nephrin mRNA表达降低明显,TNF-α、TNFR1、Caspase-8和Caspase-3 mRNA表达升高明显;与模型组比较,黄芪桂枝五物汤组、缬沙坦组Podocin、NephrinmRNA表达升高明显,黄芪桂枝五物汤组TNF-α、TNFR1、Caspase-8和Caspase-3mRNA表达降低明显,缬沙坦组TNF-α、Caspase-3 mRNA表达降低明显。Western Blot检测:与正常对照组比较,模型组Podocin、Nephrin蛋白表达降低明显,TNF-α、TNFR1、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达升高明显;与模型组比较,黄芪桂枝五物汤组Podocin、Nephrin蛋白表达升高明显,缬沙坦组Podocin、Nephrin蛋白无统计学意义,黄芪桂枝五物汤组TNF-α、Caspase-8表达降低明显,缬沙坦组TNFR1蛋白表达降低明显。TUNEL检测足细胞凋亡:与正常对照组比较,模型组与缬沙坦组升高明显,与模型组比较,黄芪桂枝五物汤组与缬沙坦组降低明显。肾脏病理学检测:模型组小鼠肾小球内系膜细胞增生和系膜基质增多明显,部分表现为局灶增生或节段硬化改变,伴有或不伴有小管间质病变,治疗组不同程度减轻了肾脏病理损伤,黄芪桂枝五物汤组作用更明显。电镜结果可见模型组肾小球系膜区电子致密物沉积,系膜细胞及系膜基质增生,足细胞足突节段性融和改变,部分可见凋亡足细胞及泡沫细胞。免疫荧光检测Nephrin、Podocin、TNF-α、TNFR1、Caspase-8和Caspase-3肾小球内定位情况,沿肾小球基底膜的外侧并与鲍曼氏囊紧邻呈点状或线性分布。免疫荧光双重标记:正常对照组仅见足细胞标记蛋白Nephrin表达,未见明显的Nephrin和CleavedCaspase-3共定位表达;模型组Nephrin表达减弱,并出现了的Nephrin和CleavedCaspase-3蛋白的共定位表达。 结论:黄芪桂枝五物汤具有改善IgAN小鼠营养状态、增加体重,减少蛋白尿,升高血清白蛋白,改善肾功能,减少IgAN小鼠肾小球内系膜区免疫复合物沉积,减轻肾脏病理损伤的作用。通过下调TNF-α、 TNFR1、Caspase-8和Caspase-3的表达,减少足细胞凋亡率,肾小球足细胞标记蛋白Podocin、Nephrin表达上调,初步研究显示其降低蛋白尿的作用机制与减少肾小球足细胞凋亡相关。因此,通过研究黄芪桂枝五物汤对TNF/TNFR1-Caspase8-Caspase3凋亡死亡受体途径的调控作用,发现黄芪桂枝五物汤可通过减少足细胞凋亡降低IgAN蛋白尿,从而延缓IgAN进展。