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骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)以骨关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特点，是导致残疾的最主要关节疾病。其确切发病机制仍不清楚，既往研究表明软骨和基质损伤引起免疫炎性反应是造成一系列病理损伤的关键环节。NALP3(NACHT-LRR-PYD-containing protein 3)炎性体由NALP3、凋亡相关斑点样蛋白接合体(ASC)和半胱天冬酶-1(Caspase-1)三个部分组成，通过模式识别连接固有免疫应答和激活炎性反应。基于前期研究基础，本研究提出假说：机械外力导致软骨膜破坏时，骨盐主要成分结晶羟基磷灰石暴露，被关节滑膜巨噬细胞表面的模式识别受体所识别，在一定条件下通过激活NALP3信号途径启动免疫炎性反应，大量分泌炎性因子，形成后续软骨基质破坏。本研究分为两个部分：(1)NALP3炎性体在羟基磷灰石致巨噬细胞炎性反应中的作用研究；(2)羟基磷灰石刺激巨噬细胞后的条件培养基对软骨细胞的损伤效应分析。
第一部分NALP3炎性体在羟基磷灰石致巨噬细胞炎性反应中的作用研究
目的：观察NALP3炎性体在羟基磷灰石刺激巨噬细胞炎性反应中的作用。
方法：以THP-1诱导分化的人巨噬细胞为实验靶细胞，采用不同羟基磷灰石染毒浓度(25，50，100，150，200μg/mL)作用6h，和固定染毒浓度(100μg/mL)观察不同时间点(1.5，3，6，12，24，36 h)获得剂量-效应关系和时间-效应关系。选择了2种NALP3炎性体拮抗剂，实验设5组：羟基磷灰石组、羟基磷灰石+NALP3拮抗1组(拮抗剂Ac-YVAD-cmk)、羟基磷灰石+NALP3拮抗2组(拮抗剂MCC950)、石英粉尘阳性对照组和培养基空白对照组。采用CCK-8法测定细胞活力，分光光度计法检测细胞内氧化应激活性氧(ROS)水平和反映细胞膜毒性指标的乳酸脱氢酶(LDH)活力，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中炎性因子IL-1β表达量。通过实时荧光定量PCR法检测NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、TGF-βmRNA表达水平，采用免疫荧光法检测NALP3、Caspase-1蛋白的表达。
结果：(1)与空白对照组比较，100μg/mL的羟基磷灰石和石英粉尘均引起巨噬细胞细胞活力下降，氧化应激ROS水平升高，炎性细胞因子IL-1β分泌明显增加(P＜0.05)。随羟基磷灰石染毒浓度增加，细胞活力下降，ROS水平升高，LDH活力升高，NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6mRNA相对表达水平呈升高趋势，NALP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平升高，提示羟基磷灰石引起巨噬细胞NALP3炎性体激活，氧化应激和炎性反应水平增高。随羟基磷灰石染毒时间延长，巨噬细胞细胞活力下降，LDH活力逐渐升高，IL-1β水平在0-6h呈升高趋势，在6-24h期间无明显变化。(2)NALP3炎性体拮抗剂Ac-YVAD-cmk、MCC950对巨噬细胞细胞活力、LDH活力无明显作用；与单纯染羟基磷灰石组比较，Ac-YVAD-cmk、MCC950均降低了巨噬细胞NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6mRNA相对表达水平，显著降低细胞分泌IL-1β水平(P＜0.05)，表明拮抗NALP3炎性体可下调炎性因子表达水平。
结论：羟基磷灰石导致巨噬细胞细胞活力下降、氧化应激水平升高和细胞毒性作用增强，并引起NALP3炎性体激活和炎性因子水平升高，特异性阻断NALP3炎性体后可下调羟基磷灰石所致炎性反应。
第二部分羟基磷灰石刺激巨噬细胞后的条件培养基对软骨细胞的损伤效应分析
目的：探讨羟基磷灰石刺激巨噬细胞后的细胞上清液(即条件培养基，Conditionedmedium，CM)对软骨细胞的损伤作用。
方法：首先观察不同浓度的条件培养基(以羟基磷灰石染毒巨噬细胞的浓度表示条件培养基浓度)和羟基磷灰石分别刺激SW1353软骨肉瘤细胞(简称软骨细胞，下同)6h的损伤反应和细胞凋亡水平。实验设6组：羟基磷灰石组、单纯条件培养基组、条件培养基+NALP3拮抗1组(CM+Ac-YVAD-cmk)、条件培养基+NALP3拮抗2组(CM+MCC950)、条件培养基+抗IL-1β抗体组(CM+anti-IL-1β)和空白对照组。通过实时荧光定量PCR法检测Ⅱ型胶原，蛋白聚糖，细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2和基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-13mRNA表达水平，通过免疫荧光法检测Ⅱ型胶原蛋白的表达。
结果：(1)羟基磷灰石直接刺激软骨细胞后蛋白聚糖mRNA相对表达水平下降，促细胞凋亡因子Caspase-3mRNA相对表达水平升高；Ⅱ型胶原、MMP-3、MMP-13、Bax、Bcl-2mRNA相对表达水平无明显变化(P>0.05)。随条件培养基染毒浓度增加，软骨细胞的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、抗细胞凋亡因子Bcl-2mRNA相对表达水平呈下降趋势，Ⅱ型胶原蛋白表达水平下降，MMP-3、MMP-13、促细胞凋亡因子Caspase-3mRNA相对表达水平呈升高趋势，促细胞凋亡因子BaxmRNA相对表达水平无明显变化。(2)与单纯条件培养基染毒组比较，特异性阻断NALP3炎性体或阻断IL-1β后，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Bcl-2mRNA相对表达水平升高，Ⅱ型胶原蛋白表达水平升高，MMP-3、MMP-13、Caspase-3mRNA相对表达水平下降。
结论：羟基磷灰石刺激巨噬细胞后的上清液可通过抑制Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达，增加基质金属蛋白酶表达，同时诱导细胞凋亡等途径引起软骨细胞损伤，特异性阻断巨噬细胞NALP3炎性体或IL-1β后可缓解该损伤作用。
第一部分NALP3炎性体在羟基磷灰石致巨噬细胞炎性反应中的作用研究
目的：观察NALP3炎性体在羟基磷灰石刺激巨噬细胞炎性反应中的作用。
方法：以THP-1诱导分化的人巨噬细胞为实验靶细胞，采用不同羟基磷灰石染毒浓度(25，50，100，150，200μg/mL)作用6h，和固定染毒浓度(100μg/mL)观察不同时间点(1.5，3，6，12，24，36 h)获得剂量-效应关系和时间-效应关系。选择了2种NALP3炎性体拮抗剂，实验设5组：羟基磷灰石组、羟基磷灰石+NALP3拮抗1组(拮抗剂Ac-YVAD-cmk)、羟基磷灰石+NALP3拮抗2组(拮抗剂MCC950)、石英粉尘阳性对照组和培养基空白对照组。采用CCK-8法测定细胞活力，分光光度计法检测细胞内氧化应激活性氧(ROS)水平和反映细胞膜毒性指标的乳酸脱氢酶(LDH)活力，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中炎性因子IL-1β表达量。通过实时荧光定量PCR法检测NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、TGF-βmRNA表达水平，采用免疫荧光法检测NALP3、Caspase-1蛋白的表达。
结果：(1)与空白对照组比较，100μg/mL的羟基磷灰石和石英粉尘均引起巨噬细胞细胞活力下降，氧化应激ROS水平升高，炎性细胞因子IL-1β分泌明显增加(P＜0.05)。随羟基磷灰石染毒浓度增加，细胞活力下降，ROS水平升高，LDH活力升高，NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6mRNA相对表达水平呈升高趋势，NALP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平升高，提示羟基磷灰石引起巨噬细胞NALP3炎性体激活，氧化应激和炎性反应水平增高。随羟基磷灰石染毒时间延长，巨噬细胞细胞活力下降，LDH活力逐渐升高，IL-1β水平在0-6h呈升高趋势，在6-24h期间无明显变化。(2)NALP3炎性体拮抗剂Ac-YVAD-cmk、MCC950对巨噬细胞细胞活力、LDH活力无明显作用；与单纯染羟基磷灰石组比较，Ac-YVAD-cmk、MCC950均降低了巨噬细胞NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6mRNA相对表达水平，显著降低细胞分泌IL-1β水平(P＜0.05)，表明拮抗NALP3炎性体可下调炎性因子表达水平。
结论：羟基磷灰石导致巨噬细胞细胞活力下降、氧化应激水平升高和细胞毒性作用增强，并引起NALP3炎性体激活和炎性因子水平升高，特异性阻断NALP3炎性体后可下调羟基磷灰石所致炎性反应。
第二部分羟基磷灰石刺激巨噬细胞后的条件培养基对软骨细胞的损伤效应分析
目的：探讨羟基磷灰石刺激巨噬细胞后的细胞上清液(即条件培养基，Conditionedmedium，CM)对软骨细胞的损伤作用。
方法：首先观察不同浓度的条件培养基(以羟基磷灰石染毒巨噬细胞的浓度表示条件培养基浓度)和羟基磷灰石分别刺激SW1353软骨肉瘤细胞(简称软骨细胞，下同)6h的损伤反应和细胞凋亡水平。实验设6组：羟基磷灰石组、单纯条件培养基组、条件培养基+NALP3拮抗1组(CM+Ac-YVAD-cmk)、条件培养基+NALP3拮抗2组(CM+MCC950)、条件培养基+抗IL-1β抗体组(CM+anti-IL-1β)和空白对照组。通过实时荧光定量PCR法检测Ⅱ型胶原，蛋白聚糖，细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2和基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-13mRNA表达水平，通过免疫荧光法检测Ⅱ型胶原蛋白的表达。
结果：(1)羟基磷灰石直接刺激软骨细胞后蛋白聚糖mRNA相对表达水平下降，促细胞凋亡因子Caspase-3mRNA相对表达水平升高；Ⅱ型胶原、MMP-3、MMP-13、Bax、Bcl-2mRNA相对表达水平无明显变化(P>0.05)。随条件培养基染毒浓度增加，软骨细胞的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、抗细胞凋亡因子Bcl-2mRNA相对表达水平呈下降趋势，Ⅱ型胶原蛋白表达水平下降，MMP-3、MMP-13、促细胞凋亡因子Caspase-3mRNA相对表达水平呈升高趋势，促细胞凋亡因子BaxmRNA相对表达水平无明显变化。(2)与单纯条件培养基染毒组比较，特异性阻断NALP3炎性体或阻断IL-1β后，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Bcl-2mRNA相对表达水平升高，Ⅱ型胶原蛋白表达水平升高，MMP-3、MMP-13、Caspase-3mRNA相对表达水平下降。
结论：羟基磷灰石刺激巨噬细胞后的上清液可通过抑制Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达，增加基质金属蛋白酶表达，同时诱导细胞凋亡等途径引起软骨细胞损伤，特异性阻断巨噬细胞NALP3炎性体或IL-1β后可缓解该损伤作用。