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芽孢杆菌是土壤中的一种重要微生物类群，它不仅被称作“微生物工厂”，更是一类被深入研究的模式细菌。芽孢杆菌遗传背景清楚，生长迅速，生物安全性好，在饲料添加剂、污水处理、生物农药等环保制剂领域有广阔的发展前景。一些芽孢杆菌能产生比普通蛋白酶更适合工业化生产的高温蛋白酶。但相比普通微生物蛋白酶，高温蛋白酶产量相对较低，价格较高。因此，本文以获得既高产、又耐热的微生物蛋白酶为目标，开展了高温蛋白酶高产菌BY25产酶条件优化、高活力组分纯化鉴定、高温纤溶酶发酵条件优化、高温纤溶酶克隆表达、定点突变及耐热机理初步究等六方面的工作。 本研究的主要结果总结如下: 1、通过实验室发酵实验获得了BY25的优化产酶培养基及产酶条件。建立了以豆饼粉为唯一氮源的最适产酶培养基——YH2培养基;通过单因子实验得到最佳培养基组成为(g/100ml):葡萄糖6，豆饼粉6，Na2HPO40.4，CaCl20.05;最佳产酶条件为:初始pH8.0，250ml三角瓶接种量5％，培养时间72 h;发现BY25在对数期结束后产酶量明显提升，产酶曲线呈明显的双峰，在培养35h和72h分别达到产酶高峰，72h后上清液蛋白酶活力高达18000 U/ml。酶学性质研究表明:该粗酶液中主要的蛋白酶可能为中性丝氨酸蛋白酶;具有良好的pH稳定性，最适反应pH为7.0，最适反应温度为55℃。 2、建立一种以离子交换和分子筛层析偶联的纯化方法，在中性低离子强度的温和条件下成功分离了租酶液中主要活性组分;并通过改进的低pH酶谱鉴定证明纯化样品中蛋白酶为单一组分;应用同源引物扩增法获得了该高温蛋白酶的全序列，结合四连杆飞行时间质谱(Q-TOF2)分析，确认为一种纤溶酶;与纳豆激酶(Subtilisin NAT)成熟肽相比，该蛋白在130、162和192三处存在氨基酸差异，分别为苏氨酸(Thr)→丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)→丝氨酸(Ser)，缬氨酸(Val)→丙氨酸(Ala);经血纤维平板分析该酶的纤溶活力达6000IU/mg。 3、以BY25高温蛋白酶的优化培养条件为基础，通过正交实验确认影响高温纤溶酶产量的主要因素，建立了纤溶酶优化产酶培养基。结果表明豆饼粉添加量是影响高温纤溶酶产量的主要因素;纤溶酶最佳培养基组成为(g/100ml):葡萄糖1，豆饼粉6，Na2HPO40.4，CaCl20.05。将纤溶酶优化培养基与LB培养基、F5M培养基、豆粉培养基以及国外新近报道的两种纳豆激酶优化培养基进行发酵效果对比，结果采用优化培养基获得的粗酶液纤溶活力较对照培养基提高6.4、23.2、5.1、514和136倍，表明优化的培养基产酶效果优于其它已报道的纤溶酶培养基。 4、从BY25中克隆高温纤溶酶基因，并在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌原核系统中进行重组表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹杂交(Western-blot)鉴定结果表明重组纤溶酶在大肠杆菌体系中成功表达;通过优化表达条件，重组纤溶酶以可溶性蛋白形式存在于细胞破碎液上清中;重组高温纤溶酶最适反应温度为60℃，酪蛋白水解活力达到2020 U/mg;四肽底物N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯酰氨-苯丙氨酸对硝基酰苯胺(N-Suc-AAPF-pNA)水解活力为3216 SU/mg。 5、以纳豆激酶为模板对高温纤溶酶130、162和192位进行单点突变，162和192位进行双点突变，成功构建并表达4个突变蛋白TNKm1、TNKm2、TNKm3、Tnkm4;和重组野生纤溶酶相比，4个突变蛋白最适反应温度均明显下降，表明130、162和192位氨基酸是导致高温纤溶酶耐热的直接原因;分子模拟结果显示，和纳豆激酶相比这三个氨基酸的替换并没有对相应位点稳定氢键的种类和数量产生影响;因此推测蛋白质表面无规则卷曲中氨基酸替换产生的局部刚性降低，有助于蛋白整体耐热性的提升，从而导致该酶最适反应温度的提高。