CsRSF1和CsRSF2在黄瓜响应白粉病菌侵染过程中的作用

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黄瓜(Cucumis sativus)是我国设施蔬菜栽培面积最大的作物之一。由单丝白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)引起的白粉病是黄瓜生产中的一种重要病害,严重影响黄瓜的产量与质量。研究表明,黄瓜中有两个NBS-LRR型蛋白(Cucsa.102240、Cucsa123410)被预测与拟南芥抗白粉病蛋白RPW8具有类似的结构域序列,我们将这两个蛋白分别命名为CsRSF1和CsRSF2蛋白。核苷酸结合富亮氨酸重复序列(NBS-LRR)型蛋白可以直接或间接识别不同来源的病原物效应子,在植物防御机制中发挥着关键的作用。但目前CsRSF1和CsRSF2基因在黄瓜调控白粉病过程中有何作用仍不清楚。本研究克隆获得CsRSF1和CsRSF2基因的CDS区序列,明确了CsRSF1和CsRSF2基因的序列特征与表达模式,并利用基因瞬时沉默和过量表达技术,初步揭示了CsRSF1和CsRSF2基因在黄瓜响应白粉病菌侵染中的作用。主要研究结果如下:(1)在黄瓜抗、感白粉病姐妹系B21-a-2-1-2和B21-a-2-2-2中分别克隆获得CsRSF1和CsREF2基因的CDS区序列,CsRSF1和CsRSF2基因序列在抗、感品系中均无差异。生物信息学分析表明,CsRSF1和CsRSF2属于典型的NBS-LRR蛋白,均含有NBS、LRR、RPW8结构域;启动子顺式作用元件中均含有防御与胁迫响应元件和各种植物激素响应元件。亚细胞定位结果表明,CsRSF1和CsRSF2蛋白均位于烟草细胞膜和细胞质中,另外在细胞核中也发现了CsRSF1蛋白。(2)应用qRT-PCR技术,分析了CsRSF1和CsRSF2在抗、感黄瓜品系不同组织中的基因表达模式及其在不同外源物质处理(ABA、MeJA、SA、ETH、GA和H2O2)和白粉病菌侵染后的基因表达情况。结果表明,CsRSF1和CsRSF2基因在抗、感黄瓜品系中均具有组织表达特异性;CsRSF1基因在抗病品种根中表达量最高,真叶中最低,感病品种真叶中最高,根和子叶中较低。CsRSF2基因在抗、感品种子叶中表达量最高,抗病品种茎中最低,感病品种根中最低。黄瓜CsRSF1和CsRSF2基因与ABA和GA等信号密切相关;黄瓜CsRSF1和CsRSF2基因均参与响应白粉病菌胁迫,而且在白粉病菌侵染早期,抗病品种中CsRSF1和CsRSF2的基因表达水平高于感病品种中的。(3)应用In-fusion同源重组方法构建了CsRSF1和CsRSF2基因的瞬时沉默载体和瞬时过表达载体,采用农杆菌瞬时转化技术,成功获得了CsRSF1和CsRSF2瞬时沉默和瞬时过表达的黄瓜子叶。接种白粉病菌后,分析黄瓜子叶的表型、病情指数与菌丝数量的变化以及防御相关基因的表达情况,研究表明CsRSF1和CsRSF2瞬时沉默能降低黄瓜对白粉病的抗性,而CsRSF1和CsRSF2瞬时过表达能提高黄瓜对白粉病的抗性,初步明确了CsRSF1和CsRSF2基因在黄瓜响应白粉病菌侵染过程中起正调控作用。
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