人甲状腺肿瘤褪黑素及褪黑素受体的表达、改变及意义 褪黑素（Melatonin,MLT）是松果体主要在黑暗中分泌的一种神经内分泌激素，具有脂溶性及水溶性，化学名为5—甲氧基—N—乙酰色胺。继往认为它的作用仅是调节生物体的生理周期性节律。近年来，随着对褪黑素研究的不断深入，人们逐渐发现它还具有很多其他的生理功能，包括调节生殖系统、免疫系统功能，调节睡眠及情绪，影响心血管及内皮功能及抗氧化、抗毒性、抗肿瘤等重要的生理、药理作用。MLT广泛的生物学作用主要由其高亲和力受体介导，MLT受体（MR）为G蛋白耦联受体（GRCP），根据1998年IUPHAR会议将MR分为mt₁、MT₂、MT₃三种亚型，在哺乳动物（包括人类）表达的MR主要是mt₁、MT₂两种亚型。虽然已经明确了如此多的重要的生理作用，但褪黑素及其受体在人体内的组织器官分布及与生物体疾病的发病关系远未完全明确，这成为对褪黑素作用机制研究的障碍并成为褪黑素领域的研究重点之一。 已经有报道褪黑素能调节哺乳动物甲状腺轴功能，影响体内甲状腺激素水平，因而研究甲状腺是否存在褪黑素受体，对于阐明褪黑素调节甲状腺功能的机制就显得非常重要。肿瘤是生物体在各种致瘤因素作用下，局部组织细胞在基因水平失去对其生长的正常调控，导致异常增生而形成的新生物。虽然肿瘤的病因及发病机制仍未阐明，但肿瘤病人的免疫功能低下、识别和清除突变细胞的免疫监视功能丧失，导致恶性肿瘤发生的理论已得到共识。动物及临床研究显示MLT对于多种肿瘤细胞具有抑制作用，但MLT与内分泌腺肿瘤间研究尚未见报道。本研究运用多种实验技术和方法，旨在阐明以下几个问题：1．成人甲状腺肿瘤患者与非肿瘤患者外周血褪黑素的表达量有无差别?是否可将外周血褪黑素作为检测甲状腺肿瘤的“标志物”?2．成人甲状腺肿瘤患者肿瘤组织与外周血褪黑素的表达量有无差别?3．成人甲状腺组织内是否存在褪黑素受体?所表达的褪黑素受体属于mt₁还是MT₂亚型?各亚型存在于甲状腺细胞的细胞内、细胞外或二者均有?4．成人甲状腺肿瘤组织内是否存在褪黑素受体及其亚型?5．甲状腺肿瘤组织褪黑素受体与正常甲状腺组织表达量有无差别?如 l 中文摘要果有，是 mt；还是 MTZ亚型？有何差别？其最终目的是为研究褪黑素与甲状腺肿瘤的发病机制的关系及将来褪黑素用于肿瘤防治提供依据。 本研究的主要研究方法和结果：第一部分：方法：选择非肿瘤甲状腺良性疾病患者 10例为对照（包括甲状腺炎 2例，Graves病 7例，单纯性甲状腺肿 1例）及甲状腺肿瘤患者20例于清晨4：00—6：00抽取外周血，离心后取上清；同时取肿瘤患者手术标本，加入生理盐水稀释后匀浆取上清，按照ELISA试剂盒说明测定外周血及肿瘤组织MLT浓度。结果：1．甲状腺肿瘤组组织匀浆上清MLT浓度较自身外周血明显增高门 余倍～40o余倍人其中甲状腺腺癌组O＜o刀5＼甲状腺腺瘤组O＜0刀1)，甲状腺腺癌加腺瘤组O＜0刀1卜2．各组组织匀浆上清＊u浓度：甲状腺腺癌组高于腺瘤组O阿刀5)，和瘤旁组织组中功力1人 甲状腺腺瘤组高于瘤旁组织组，但无统计学差异；3．各组外周血MLT浓度：甲状腺腺癌组中有二例低于对照组平均值，5例高于对照组平均值；甲状腺腺瘤组有10例低于对照组平均值，3例高于对照组平均值；但腺癌组及腺瘤组与对照组相比均无统计学差异。第M部分：方法：取20例本院甲状腺肿瘤（腺瘤及腺癌）及13例瘤旁组织手术标本，经固定、脱水、包埋后制成组织切片，采用SP法组化染色，一抗为鼠抗人ltl和MTZ受体单克隆抗体。结果发现，经过MTZ受体抗体处理的切片，甲状腺细胞膜、细胞浆、细胞核均有棕褐色阳性染色，其中甲状腺腺癌组呈强阳性（＋＋＋），而甲状腺腺瘤及瘤旁正常组织组呈较弱阳性(上～十人经过ltl受体抗体处理的切片，甲状腺细胞膜、细胞浆、细胞核均有较弱棕褐色阳性染色，三组均为（上～十）。第三部分：方法：取5对甲状腺肿瘤（腺瘤及腺癌）及瘤旁组织手术标本，腺瘤与腺癌组按性别、年龄、取样时间等因素配对（以排除影响MR的因素）。抽提甲状腺肿瘤及瘤秀组织总RNA，以ltl、MTZ受体引物进行扩增、逆转录、电泳，用RT—PCR半定量分析褪黑素受体亚型mRNA表达的改变。结果：人甲状腺腺瘤、腺癌及瘤旁正常甲状腺组织均有［ti、MT。受体表达。甲状腺腺瘤组It［、MTZ受体亚型表达量与正常甲状腺组织无差异（P＞0刀5）。甲状腺腺癌组＊n受体亚型表达量较正常甲状腺组织明显增加（P＜0刀5），＞h受体亚型表达量无差异（P＞0刀5）。说明成人甲状腺肿瘤组织中存在Iii、MTZ受体亚型。其中腺癌MTZ高表达，与免疫组化结果相同。 结论：甲状腺肿瘤患者肿瘤部位的MLT水平较自身外周血明显增高，但外 一3一