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研究背景:中性粒细胞作为人类髓系白细胞中最丰富的一种细胞,是抵御包括细菌、病毒等多种病原体的主要应答者。成熟的中性粒细胞在调控因子作用下或保留在骨髓中或释放入血,释放入血的中性粒细胞在各种整合蛋白及趋化因子的作用下滚动迁移,从血管到达局部组织发挥作用。中性粒细胞在激活和调节天然免疫及适应性免疫中发挥重要作用,近些年的研究发现,中性粒细胞不仅存在于抗感染环节中,在肿瘤中也被大量发现,被称为肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils,TANs）,TANs是肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）的重要组成部分。作为TME中重要的炎性细胞,TANs具有多样性及异质性,表现出抗肿瘤及促肿瘤的双重作用。2009年美国学者Fridlender提出命名,将介导抗肿瘤作用的TANs称为N1型TANs,介导促肿瘤作用的TANs称为N2型TANs。在TME复杂的大环境中,TANs可发生极化,并且发现两种类型TANs可相互转化,这一过程可受到细胞因子及表观遗传学信号的诱导调节。既往大多数研究着重聚焦在N2型TANs的促肿瘤方面,对N1型TANs研究较少且局限,忽视了其本身的抗肿瘤作用及应用前景。先前关于抗肿瘤机制的研究表明,N1型TANs可通过直接的细胞毒作用抗肿瘤,其中主要是指抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC）;还可以通过激活TME中T细胞间接发挥抗肿瘤作用,同时TME中各种趋化因子、生长因子及细胞因子影响两种类型TANs的相互转化,作为TANs特有的一种炎性细胞死亡方式,中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）,它是一种由DNA和蛋白质组成的网状结构,或将成为近年的研究热点。中性细胞弹性蛋白酶（elastase neutrophil expressed,ELANE）作为丝氨酸蛋白酶的一个亚家族,除弹性蛋白酶外,还可以水解许多蛋白质,前人的研究中将其视为一种促肿瘤因素,直到最近美国学者Cui等得出了不同的研究结果,在体外实验中观察到ELANE是中性粒细胞条件培养基中的主要抗肿瘤蛋白,可以选择性杀伤肿瘤细胞并抑制肿瘤的形成,同时对非肿瘤细胞没有杀伤作用。在后续动物模型体内验证实验中,发现ELANE的抗肿瘤作用受到了TME中丝氨酸蛋白酶抑制剂的削弱。作为32%氨基酸同源性的猪胰腺弹性蛋白酶（porcine pancreatic elastase,PPE）是猪胰腺来源的一种丝氨酸蛋白酶,与ELANE具有相似的蛋白质结构和主要底物特异性,但不易受丝氨酸蛋白酶的抑制作用,从而增加对肿瘤的杀伤效果。同时ELANE抑制肿瘤生长并诱导CD8+T细胞介导的非特异性效应,并且TANs与T细胞的作用是相互的,CD8+T细胞耗竭将减弱TANs的抗肿瘤作用。基于以上研究现状及背景,根据实验目的,首先构建人源化的PPE,命名为HPPE（human porcine pancreatic elastase）,前期调查发现人胰弹性蛋白酶1（chymochypsin like elastase 1,ELA1）与ELANE具有相似编码序列,也是弹性蛋白酶基因,综上所述本研究确定了关键基因,旨在探究ELANE、ELA1及HPPE的抗肿瘤作用,以期为肿瘤治疗提供新的思路。研究方法:1.根据基因序列信息,得到目的基因质粒,根据后续实验需要确定表达载体,该载体需带有荧光标签及筛选标志,方便后续细胞转染。在目的质粒及载体上选择合适酶切位点,将目的质粒与载体双酶切后进行T4连接,连接产物进行转化后扩大培养,从而构建重组表达载体及空载体。载体的命名分别如下述,空载Lenti-p EF1-IFNlp-cop GFP-Puro（简称PEF）,空载无荧光Lenti-p EF1-IFNlp-Puro（简称PEF无GFP）,重组表达载体分别为,Lenti-p EF1-IFNlp-ELANE-cop GFP-Puro（简称ELANE+PEF）,Lenti-p EF1-IFNlp-ELANE-Puro（简称ELANE+PEF无GFP）,Lenti-p EF1-IFNlp-ELA1-cop GFP-Puro（简称ELA1+PEF）,Lenti-p EF1-IFNlp-ELA1-Puro（简称ELA1+PEF无GFP）,Lenti-p EF1-IFNlp-HPPE-cop GFP-Puro（简称HPPE+PEF）,Lenti-p EF1-IFNlp-HPPE-Puro（简称HPPE+PEF无GFP）。2.对构建的重组表达载体及空载体进行验证,包括酶切验证及菌落PCR验证,产物经过琼脂糖凝胶电泳将其与目标条带位置进行对比,而后将重组载体送测序,根据结果比对判断重组表达载体及空载体构建是否成功。将构建成功的重组表达载体转入大肠杆菌留取菌种长期保存并扩大培养,提取质粒方便用于后续实验。3.将构建成功的重组表达载体及空载体通过慢病毒介导转染至293T细胞中,根据重组载体表达情况,对于有荧光基团表达的重组载体在转染期间观察荧光表达,进行药物筛选,无荧光表达的重组载体直接进行药物筛选。筛选后的细胞继续培养直至细胞状态良好,转染成功的稳转细胞系进行冻存及扩大培养用于后续实验。4.对转染细胞进行验证,分别提取RNA在转录水平进行q PCR实验,提取蛋白在翻译水平进行western blot实验,从而验证目的蛋白的表达。5.对构建成功的过表达细胞系进行功能验证,选取多种人肺癌细胞及人乳腺癌细胞系,分别进行目的蛋白对肿瘤细胞增殖影响及对肿瘤细胞杀伤作用的实验。研究结果:1.将构建成功的重组表达载体分别进行双酶切鉴定及菌落PCR鉴定,产物经过琼脂糖凝胶后显影均可见目标条带,结合测序结果对比,提示重组载体构建成功。2.进行慢病毒转染构建稳转细胞,根据重组载体情况,有荧光表达的稳转细胞系在倒置荧光显微镜下可见荧光表达,同时进行药物筛选后,可见阳性细胞比例逐渐升高,提示稳转细胞系构建成功。对于无荧光的稳转细胞系常规药物筛选,后进行稳转细胞系的表达检测。构建的稳转细胞系分别命名如下述,PEF-293T、PEF无GFP-293T、ELANE+PEF-293T、ELANE+PEF无GFP-293T、ELA1+PEF-293T、ELA1+PEF无GFP-293T、HPPE+PEF-293T、HPPE+PEF无GFP-293T。3.对构建的稳转细胞系进行验证,q PCR结果显示重组表达载体分别对比相应空载有明显的目的基因高扩增（P＜0.0001）,western blot结果可见目标蛋白的高表达（P＜0.01）,稳转细胞系构建成功。4.功能实验结果提示,与空载组相比,实验组人肺癌细胞及乳腺癌细胞的增殖明显减缓（P＜0.05）,并且实验组对人肺癌细胞及乳腺癌细胞的杀伤作用明显高于空载组（P＜0.05）。研究结论:1.成功构建了ELANE、ELA1及HPPE的重组表达载体。2.成功构建了表达ELANE、ELA1及HPPE的稳定转染细胞系。3.通过细胞增殖实验及杀伤实验证明了ELANE、ELA1及HPPE的蛋白上调可抑制人肺癌细胞及乳腺癌细胞的增殖,并对人肺癌细胞及乳腺癌细胞有杀伤作用。