1研究背景睡眠障碍是一种持续相当长时间的睡眠质和(或)量让人不满意的状况,主要表现为入睡困难、维持睡眠困难、过早觉醒和睡后无恢复感。当今社会,人类面临的压力空前膨胀,老龄化人口急剧增长,睡眠障碍已成为“悄然扩展的流行病”严重危害人类健康,一项睡眠问卷调查显示,我国睡眠障碍患病率高达42.7%,其中失眠是各种睡眠障碍最常见的症状,对成人失眠症流行情况的调查结果有相当大的差异,位于10.2%-37.8%之间,女性发病率明显高于男性,年龄越大,失眠发病率越高。慢性疾病是失眠非常重要的危险因子,据统计,75%-90%的失眠患者有伴随疾病状态的并发性失眠[4],特别是年龄超过45岁的患者,其失眠大多与脑动脉硬化及颈椎病引起的慢性脑供血不足有关,但慢性脑缺血与睡眠障碍相关性的流行病学调查鲜有报道。我们的前期实验采用小平台水环境法监测大鼠睡眠状态。大鼠保持觉醒状态时,能立于高于水平面的小平台上,否则落水,则落水次数与睡眠时间负相关。结果证实慢性脑缺血大鼠落水次数较正常大鼠显著下降,这提示慢性脑缺血大鼠保持更高的觉醒度。该实验首次利用睡眠剥夺模型在行为学上证实睡眠障碍和慢性脑缺血确有相关性,但分子机制仍不明确。脑缺血是脑灌流动脉狭窄或闭塞所引起的一种很常见的缺血性脑血管疾病。其病因复杂,缺乏能逆转缺血病灶的药物,更没有专门应用于防治其伴发的睡眠障碍的药物,只是笼统的利用镇静催眠、抗抑郁、抗组胺等疗法解决患者继发失眠问题,往往副作用大、容易成瘾。中医认为“眩晕”、“头痛”、“失眠”、“健忘”等均有“慢性脑缺血”的病理生理基础,因此利用中药复方多成分,多靶点的优势,采用改善脑供血的方法治疗失眠收效良好。“乌龙丹”是临床用于脑供血不足的经验方,常用于治疗脑梗塞、脑栓塞、短暂性脑缺血发作、中风后遗症及恢复期、脑动脉硬化、脑萎缩及高血压头晕头痛、颈椎病(椎-基底动脉供血不足型)、颅脑外伤或手术后遗症等缺血性脑病,效果显著,现已经开始用于治疗慢性脑缺血相关的睡眠障碍。本课题组前期实验研究表明乌龙丹具有扩张脑血管、抗血小板聚集、改善血液流变性和微循环等作用,能上调大鼠皮层及海马区NR1、NR2B的蛋白表达水平,改善慢性脑缺血大鼠学习记忆功能。在Morris水迷宫实验及大鼠避暗实验中,乌龙丹能缩短大鼠寻找平台的潜伏期,减少错误次数,提高大鼠的空间学习能力及被动学习能力；通过检测,我们还发现长期持续的慢性脑供血不足,导致食欲素原mRNA的表达升高,激活了食欲素神经元,作为觉醒启动子之一的食欲素系统可以增加觉醒、抑制睡眠,在睡眠的中枢调节作用中起着关键的作用。前期的实验从行为学上初步证实了睡眠障碍与慢性脑缺血有明确相关性,但对其具体分子机制只做了初探,且乌龙丹对睡眠障碍——慢性脑缺血可能潜在的并发症是否有治疗作用的靶点,尚不清楚。2目的和意义针对以上提出的2个问题：1、慢性脑缺血伴发睡眠障碍的具体机制不明；2、乌龙丹对慢性脑缺血伴发睡眠障碍的作用靶点未知,本实验选取与睡眠-觉醒周期密切相关的生物钟基因与中枢神经递质作为检测指标,旨在分子水平进步证实大鼠慢性脑缺血与睡眠障碍的相关性,探索慢性脑缺血伴发睡眠障碍的具体机制。同时,初步定位乌龙丹治疗大鼠慢性脑缺血伴发睡眠障碍的作用靶点,为其临床治疗慢性脑缺血伴发失眠提供理论依据。3实验方法3.1乌龙丹对慢性脑缺血大鼠松果体钟基因表达的影响动物适应性喂养1周后,随机分为3组：假手术组、模型组、乌龙丹给药组[相当于生药量4.4g/(kg-d)],每组5只。采用改良式双侧颈总动脉永久性结扎法建立大鼠慢性脑缺血模型,假手术组只分离双侧颈总动脉,不结扎,其余处理同手术组。造模3周后,灌胃给药3周,并持续监测各组大鼠体重。SYBR Green实时定量PCR检测大鼠松果体钟基因Clock、Bmall、Per1表达的变化。3.2乌龙丹对慢性脑缺血大鼠中枢氨基酸类神经递质含量的影响动物适应性喂养1周后,随机分为3组：假手术组、模型组、乌龙丹给药组[相当于生药量4.4g/(kg-d)],每组4只。采用改良式双侧颈总动脉永久性结扎法建立大鼠慢性脑缺血模型,假手术组只分离双侧颈总动脉,不结扎,其余处理同手术组。造模3周后进入慢性脑缺血期,继而灌胃给药,3周后,处死并冰台上分离大鼠海马及脑干,冷冻离心后分离上清液,采用高效液相色谱荧光检测法对大鼠脑干和海马的天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、Y-氨基丁酸进行定量。色谱条件：Hypersil ODS色谱柱,4.0×125mm,粒径5μm；流动相(A)：10mmol·L-1Na2HPO4PH7.2缓冲液(PB)；流动相(B)：PB+甲醇+乙腈(50+35+15)。线性梯度：在0-10min内,流动相B以线性从0%上升到40%。流量：1.0mL·min-1。柱温40℃。检测波长：激发波长340nm,发射波长450nm。3.3统计学分析采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数±标准差(X±S)表示,统计方法使用重复测量数据的方差分析,单因素方差分析(One-way ANOVA)。方差齐时,总体均数的比较采用one-way ANOVA,各组间多重比较采用LSD法和Dunnett-t法,方差不齐时总体均数的比较采用Welch法,各组间多重比较采用Dunnett’s T3法检验。P<0.05具有统计学意义。4结果4.1乌龙丹对慢性脑缺血大鼠体重的影响假手术组体重呈进行性增长,精神状态良好、反应灵敏、皮毛光泽；模型组大鼠体重增长缓慢,反应迟钝、皮毛枯萎。结果显示术前各组大鼠体重无统计学差异,术后1周模型组与假手术组体质量有显著差异(P=0.015)。术后3周进入慢性脑缺血期,继而给药3周,测量终体质量,模型组体质量显著低于假手术组(P=0.000)和给药组(P=0.013),给药组与假手术组无显著差异。4.2乌龙丹对慢性脑缺血大鼠松果体钟基因表达的影响结果显示,模型组大鼠松果体Clock mRNA的表达水平显著低于假手术组(P<0.01),给予乌龙丹后上调了慢性脑缺血大鼠Clock mRNA的表达水平(P<0.01)；模型组大鼠松果体Perl mRNA的表达水平显著低于假手术组(P<0.05)；乌龙丹干预后未见显著差异；慢性脑缺血不影响大鼠Bmall表达。4.3乌龙丹对慢性脑缺血大鼠中枢氨基酸类神经递质含量的影响结果表明,慢性脑缺血模型未能影响海马天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸含量的变化,但能导致兴奋性氨基酸类神经递质谷氨酸含量的显著上升(P<0.05),给予乌龙丹治疗后,慢性脑缺血大鼠海马谷氨酸含量显著降低至正常水平(P<0.05)；海马各组间兴奋性氨基酸含量总和与抑制性氨基酸含量总和的比值有显著差异,与假手术组相比,模型组比值显著升高(P<0.01),与模型组相比,给药组比值显著降低(P<0.05),给药组和假手术组无显著差异；模型组与假手术(P<0.05)、给药组(P<0.05) Glu/GABA差异均有统计学意义。慢性脑缺血模型未能影响脑干天冬氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸含量的变化,但导致抑制性氨基酸类神经递质甘氨酸含量的显著降低(P<0.01),乌龙丹能增加慢性脑缺血大鼠脑干甘氨酸含量(P<0.05)；各组间兴奋性氨基酸含量总和与抑制性氨基酸含量总和的比值有显著差异,与假手术组相比,模型组比值显著升高(P<0.01),与模型组相比,给药组比值显著降低(P<0.05),给药组和假手术组无显著差异；但Glu/GABA各组间无统计学差异。5结论5.1慢性脑缺血改变大鼠生物钟基因的表达慢性脑缺血下调大鼠松果体Clock、Perl基因的表达,提示慢性脑缺血可能通过调控节律基因的表达而导致失眠。5.2慢性脑缺血影响大鼠中枢氨基酸类神经递质释放慢性脑缺血大鼠神经功能的兴奋状态占优势,致使兴奋性神经递质增加,而抑制性神经递质减少。提示慢性脑缺血为睡眠障碍的潜在病因。5.3乌龙丹改善慢性脑缺血大鼠钟基因与氨基酸类神经递质的表达乌龙丹通过调节松果体钟基因的表达,同时降低大鼠中枢兴奋性／抑制性神经递质比值,达到治疗慢性脑缺血继发的睡眠障碍。