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裸甲藻亚胺毒素（Gymnodimines,GYMs）属于环亚胺类毒素（Cyclic imines,CIs）,是一种由甲藻产生、广泛分布的海洋生物毒素。GYMs毒性强,有“快速作用”特征,可通过食物链或气溶胶进入生物体,对人类健康和水产养殖造成巨大危害。目前已开发的检测方法有小鼠生物法、液相色谱串联质谱法和受体结合法等,这些方法费用昂贵、操作复杂、特异性低,急需一种特异、灵敏、高效的检测方法。核酸适配体是一种新型的分子识别元件,被称为“化学抗体”。它是一种能与靶标特异性结合的单链寡核苷酸,通过指数富集的配体系统进化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术筛选,有特异性好、稳定性高、易于合成、便于修饰和免疫原性低等优点。目前尚没有GYMs适配体的报道。常规的适配体筛选采用固定靶标的策略,然而GYMs是脂溶性分子,不带电荷、分子量小、化学基团数量有限,缺少固定所需基团,难以固定,筛选其适配体具有一定挑战性。本课题采用固定文库、而非固定毒素的捕获SELEX（Capture-SELEX）来筛选裸甲藻亚胺毒素A（Gymnodimine-A,GYM-A）适配体,并对适配体进行鉴定、优化,通过分子结构预测、分子对接和分子动力学模拟,探讨适配体与GYM-A结合的结构基础,同时借助灵敏、快速、高通量、低成本的生物膜干涉技术（Biolayer interferometry,BLI）,研制基于适配体的生物传感器,获得如下主要结果。首先,采用捕获SELEX筛选获得了GYM-A的适配体。从随机合成的库容约1015的初始ss DNA文库开始筛选,每一轮包括文库固定、靶标孵育、PCR扩增和单链制备四个步骤。筛选进程中,用微囊藻毒素LR（microcystin-LR,MC-LR）作为反筛靶标。监测每一轮ss DNA的回收率,经过12轮筛选,回收率不再提升时,将该轮富集的ss DNA进行克隆测序,得到的序列用Clustal X 2.1软件进行聚类分析,分成了6个家族。用mfold软件预测序列的二级结构和吉布斯自由能,合成每个家族中相似性较高或吉布斯自由能最低的序列作为候选适配体,经BLI技术测定与毒素的亲和力,获得KD值最低（KD=288 n M）的适配体G48。对G48进行截短优化,得到了与毒素亲和力提高了约两倍的适配体G48nop（KD=95.30 n M）。圆二色谱法分析G48nop,发现波谱在216 nm和273 nm处有正峰,245 nm处有负峰,提示G48nop的二级结构中含有平行型G-四联体和B型双链DNA两种结构。加入GYM-A后光谱发生偏移,证明GYM-A与G48nop结合。BLI分析中,G48nop与其它10种有代表性的海洋生物毒素没有亲和力,与仅含有GYM-A或混合毒素中含有GYM-A的样品有亲和力,证明G48nop的特异性良好。微量热泳动分析中,G48nop与GYM-A结合的KD为34.50±1.72 n M,与其它4种有代表性的海洋生物毒素无亲和力或低亲和力,进一步验证了G48nop与GYM-A有良好的结合亲和力和特异性。其次,表征了GYM-A与适配体G48nop结合的结构基础,推断了GYM-A与G48nop可能的结合模式。运用QGRS mapper在线软件、3D-Nus网站、RNA composer网站、Discovery studio 4.5软件、Py MOL 2.52软件和NAMD 2.10软件,构建了九种以G-四联体为基础的G48nop三维结构模型。Gromacs 5.1.4分子动力学模拟显示平行型G-四联体在10 ns内变化最小、结构最稳定,提示G48nop形成了以平行型G-四联体为基础的三维结构,命名为Q3,其由两层环状平面通过π-π堆积叠加而成,每层环状平面内的4个鸟嘌呤通过Hoogsteen氢键连接。运用Ox DNA2.4软件、Discovery studio 4.5软件和Gromacs 5.1.4软件,构建了一种含有发夹结构的G48nop三维结构,命名为H1,H1由环和茎两部分组成,茎部有9对碱基通过氢键形成稳定碱基对。采用Auto Dock 4.2软件和Auto Dock Vina 1.2.0软件,将Q3和H1分别与GYM同类物进行分子对接、结合能计算,结果显示:GYM-A可通过12个CH…π键结合在Q3顶部的凹槽,也可通过2个氢键和7个CH…π键结合在H1茎部的空腔处;Q3、H1与GYM-A的结合能ΔG分别为-9.5 kcal/mol和-12.1kcal/mol,结合能均较低,而H1的结合能更低,说明GYM-A与H1结合时更稳定;GYM-B、GYM-C分别与Q3或H1的结合能均比GYM-A高,说明Q3或H1均可特异地结合GYM-A。Gromacs 5.1.4分子动力学模拟表明100 ns中,Q3的均方根偏差（Root mean square deviation,RMSD）波动程度大于H1,Q3与GYM-A形成复合物的RMSD波动程度大于H1形成的复合物,说明H1单体更稳定,H1与GYM-A形成的复合物更稳定,这进一步验证了分子对接结果的可靠性。因此,GYM-A结合在H1的茎部,且这种结合方式更为稳定。最后,基于BLI技术,研制了检测GYM-A的适配体生物传感器。BLI技术检测步骤设置为定基线、适配体耦联、再次定基线、结合和解离。参考国际协调会议的标准来表征传感器的性能和可行性。表征内容包括线性范围、检出限、定量限、特异性、精密度、重复性和准确性等。检测GYM-A的适配体传感器,其线性范围为55—875 n M,检出限为6.21 n M,定量限为20.72 n M,灵敏度高。与四大类海洋生物毒素中的代表性毒素均无交叉反应,可在多种毒素存在的复杂环境中检测到GYM-A,特异性好。组间和组内的相对标准偏差为0.34—4.57%,精密度高。每个传感器可重复使用至少20次,重复性好。实际样品检测中回收率为96.65—109.67%,回收率较高,准确度好。综上所述,本研究在国内外首次筛选获得了与GYM-A具有高亲和力和强特异性的适配体G48nop,分子计算揭示了G48nop与GYM-A结合时可能形成发夹型三维结构,并研制了性能良好的基于该适配体的生物传感器。研究成果为缺少固定所需基团的小分子提供了适配体筛选的成功案例,为探究小分子与适配体特异结合提供了研究思路,为进一步推动适配体传感器在海洋生物毒素检测中的应用提供了技术储备。