论文部分内容阅读
恶性肿瘤是目前影响人类健康的主要大敌,转移是恶性肿瘤的主要特征之一,是肿瘤晚期最具破坏性的阶段。目前临床对肿瘤转移的治疗仍缺乏有效手段,肿瘤转移仍是导致肿瘤复发和患者死亡的主要原因,这迫切需要基础和临床研究加强对肿瘤细胞转移调控的深入探究,以期为肿瘤转移治疗提供新的机制阐释和潜在分子靶标。肿瘤转移是一个连续、渐进的多因素、多步骤的动态过程,肿瘤细胞在转移过程中往往伴随着迁移功能的改变。因此,探究肿瘤细胞迁移功能的调控作用及机制对干预肿瘤转移治疗有着至关重要的作用。TBK1(Tank-binding kinase 1)作为一种丝苏氨酸蛋白激酶,不仅在天然免疫应答、炎症、能量代谢及自身免疫疾病过程中发挥重要作用,在肿瘤的发生发展中也扮演了重要角色,参与了细胞有丝分裂、自噬、增殖、存活以及肿瘤免疫应答等多个生物学过程,但目前关于TBK1调控肿瘤细胞迁移的研究较少,且缺乏深入的分子机制探讨。TBK1的同源分子IKKε(inhibitor ofκB kinaseε)也在肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用,更是重要的乳腺癌致癌基因,对乳腺癌发生发展至关重要。TBK1是否对于肿瘤细胞迁移功能具有重要的调控作用,TBK1通过调控基因转录还是通过作用于新的蛋白质底物来发挥调节肿瘤细胞迁移功能,TBK1在调控肿瘤细胞迁移功能方面是否与其同源分子IKKε发挥类似的作用和分子调控机制,这些科学问题都需要进一步的研究和探索。本研究以TBK1对肿瘤细胞的迁移调控作用和分子机制为着力点,鉴于TBK1在乳腺癌中的作用研究较少,目前也无专门研究涉及TBK1对乳腺癌迁移作用的调控,因此我们选取乳腺癌为研究的切入点;同时对TBK1的同源分子IKKε展开平行研究,以期为肿瘤细胞的迁移调控机制提供新的理论认识,为临床治疗乳腺癌转移提供新的潜在分子靶标。首先我们从临床样品数据库TCGA(The Cancer Genome Atlas)、CPTAC(The National Cancer Institute’s Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium)的数据挖掘入手,发现TBK1在乳腺癌中的转录水平和蛋白表达水平都升高,且TBK1的转录水平可能与乳腺癌淋巴转移呈正相关,而与患者生存率呈负相关。乳腺癌组织芯片免疫组化检测也表明TBK1及磷酸化TBK1(p-TBK1,Ser172)在乳腺癌组织中的表达量升高,TBK1表达水平可能与乳腺癌病理分级呈正相关,p-TBK1的表达水平与患者生存期呈负相关。我们参照上述模式对TBK1同源分子IKKε进行分析,发现在TCGA、CPTAC数据库样本中IKKε在乳腺癌中的转录水平和蛋白表达水平都升高,且蛋白表达升高主要体现在三阴性乳腺癌中,但基因转录水平增高与患者生存率无关。组织芯片检测发现,IKKε及磷酸化IKKε(p-IKKε,Ser172)表达量可能与患者的病理分级呈正相关,但与患者生存期无明显相关性。因此,临床肿瘤标本数据提示TBK1的表达水平及活化水平与乳腺癌的淋巴转移及患者生存期密切相关,提示TBK1对于肿瘤转移可能存在重要的调控作用而IKKε及p-IKKε的表达水平也与乳腺癌的发生和进展有一定的相关性。接下来我们利用体内外的研究证实TBK1和IKKε对于肿瘤细胞体外迁移和体内转移的调控作用。我们利用CRISPR(Clustered regularly interspaced palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated protein 9)基因编辑技术构建了小鼠乳腺癌细胞系4T1-Luc(4T1 cells genetically labelled with luciferase)TBK1敲除细胞系。通过体外Transwell等实验以及小鼠尾静脉转移瘤造模发现TBK1敲除后,小鼠乳腺癌细胞体外迁移和体内转移能力显著降低。在乳腺癌细胞中进行TBK1过表达能促进小鼠乳腺癌细胞体外迁移和体内转移。我们使用TBK1抑制剂Amlexanox以及MRT67307抑制乳腺癌细胞中TBK1活性后,发现上述抑制剂能有效抑制乳腺癌细胞体外迁移和体内转移能力。这些结果充分证实TBK1促进小鼠乳腺癌细胞体外迁移和体内转移的重要作用。在平行进行的IKKε研究中,我们发现IKKε敲除后小鼠乳腺癌细胞的体外迁移能力和体内转移能力也都明显下降。为进一步探究TBK1与IKKε是否存在协同作用,我们构建了小鼠乳腺癌4T1-Luc的TBK1、IKKε双敲除细胞系,并通过体内外实验发现TBK1联合IKKε敲除后,小鼠乳腺癌细胞的体外迁移能力和体内转移能力下降更为明显(较于单个分子敲除),两者在调控乳腺癌细胞迁移中存在协同作用。我们进而利用CRISPR/Cas9技术构建了人乳腺癌细胞系MDA-MB-231-Luc的TBK1敲除细胞系,利用RNA干扰技术敲低了人乳腺癌MDA-MB-468、MCF-7中TBK1的表达水平。重复上述实验,也得到一致结论,即TBK1敲除或敲低后,人乳腺癌细胞体外迁移和体内转移能力降低。使用TBK1抑制剂Amlexanox后发现人乳腺癌细胞的体外迁移能力也明显下降。我们对IKKε也展开了上述研究,发现在人乳腺癌中敲低IKKε后,人乳腺癌细胞的体外迁移能力下降。TBK1联合IKKε敲低后,较单个分子敲低而言,细胞的体外迁移能力下降更为明显,说明TBK1与IKKε在人乳腺癌中也具有类似的协同作用。我们还初步验证了TBK1对人肝癌细胞系Hep G2、HCCLM3,人结肠癌细胞系RKO的迁移调控作用。在Hep G2和RKO中敲除TBK1后,两者的体外迁移能力都下降。对RKO敲除细胞系构建体内转移瘤模型后发现,TBK1敲除也能抑制RKO细胞的体内转移。此外,HCCLM3肝癌细胞系在给予Amlexanox处理后,细胞的体外迁移能力也明显下降。上述实验说明TBK1参与调控肿瘤细胞的迁移功能,TBK1表达降低后能显著抑制肿瘤细胞的迁移,TBK1的同源分子IKKε也有类似功能,与TBK1具有协同作用。为了探索TBK1和IKKε调控肿瘤细胞迁移功能的分子机制,我们分别从基因转录组、互作分子蛋白质组以及磷酸化蛋白组三个维度出发,逐步寻找TBK1调控细胞迁移的关键分子,最后从分子水平、细胞水平及活体实验对预测的关键分子进行验证。TBK1同源分子IKKε参照TBK1的研究模式平行展开研究。我们对构建好的TBK1-KO(TBK1 knockout)、IKKε-KO(IKKεknockout)、TBK1-IKKε-DKO(TBK1 and IKKεdouble knockout)4T1-Luc细胞进行基因转录组RNA测序,发现TBK1可能通过调控Rho蛋白家族相关分子的表达来调节细胞迁移,AMP活化的蛋白激酶[Adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]可能也在其中发挥作用,而IKKε可能通过调控整合素分子的表达来调节细胞迁移。TBK1联合IKKε敲除后不仅可能调控细胞固有的迁移及粘附能力,还可能改变肿瘤微环境包括生长因子的分泌及免疫细胞浸润情况,从多角度来调控肿瘤细胞迁移。我们通过蛋白质谱检测分析TBK1的蛋白互作分子发现,TBK1可以与AMPKα亚基及Cdc42(cell division cycle 42)结合,免疫沉淀实验证实TBK1确实可以结合AMPKα及Cdc42。与TBK1发生互作的蛋白分子除参与细胞运动、骨架重塑调节外,还与糖脂代谢、线粒体功能和能量代谢相关。我们对构建好的敲除细胞系进行磷酸化蛋白组学检测,发现TBK1可能通过磷酸化修饰调节AMPK及Rac1(Ras-related C3Botulinum toxin substrate 1)/Cdc42,参与细胞的迁移调控;而IKKε可能通过对Rap1的调节来参与细胞的迁移调节,上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)可能在其中扮演了重要角色。TBK1联合IKKε敲除能从肿瘤细胞本身、肿瘤微环境调节等多角度调控肿瘤细胞迁移,值得关注的是TBK1联合IKKε敲除还可能与乳腺癌内分泌抵抗、PD1免疫检查点功能异常有关。我们通过分子实验、细胞实验以及动物实验对上述组学研究所预测的信号通路进行验证。我们发现TBK1敲除增强AMPKα(Thr172)的水平,降低Rac1、Cdc42的GTP结合状态。使用AMPK激动剂二甲双胍能进一步增强TBK1敲除对乳腺细胞体外迁移的抑制作用,而使用AMPK抑制剂Compound C能逆转TBK1敲除对乳腺癌细胞迁移的抑制作用;在体内转移模型中,我们发现通过二甲双胍提高乳腺癌细胞中AMPK活性能增强TBK1敲除对肿瘤细胞体内转移的抑制作用,有效延长小鼠生存期。当使用Compound C抑制AMPK后,野生型4T1-Luc细胞内Rac1和Cdc42的活性显著升高,而TBK1敲除细胞中Rac1和Cdc42活性的抑制得以部分逆转,提示TBK1主要通过抑制AMPK的活化增强Rac1/Cdc42的活性,从而促进肿瘤细胞的迁移功能,促进肿瘤的转移。在IKKε敲除的4T1-Luc中,AMPK的活化与Rac1、Cdc42的GTP结合状态均未受到显著影响,提示IKKε并不能像TBK1一样通过调控AMPK和Rac1、Cdc42的活性来调节细胞迁移。我们发现IKKε敲除后,N-Cadherin水平下调,提示IKKε可能通过调节小鼠乳腺癌细胞的上皮间质转化抑制肿瘤细胞迁移;IKKε敲除后,磷酸化ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase 1 and 2)(p-ERK1/2)水平下降;我们推测IKKε可能通过影响ERK1/2的磷酸化水平,调控肿瘤细胞的上皮间质转化,进而调节肿瘤细胞的迁移和转移能力。综上所述,我们的研究揭示了TBK1和IKKε在调节乳腺癌细胞(及其他肿瘤细胞)的体外迁移和体内转移中的重要作用,并且利用多组学分析结合实验验证发现了TBK1和IKKε调控肿瘤细胞迁移能力的可能机制。在临床意义层面,我们较系统地检测了TBK1和IKKε的表达和活化情况,发现了TBK1和IKKε与临床乳腺癌进展或转移的重要关联性。在科学发现层面,我们使用体外迁移模型和体内转移模型,证实了TBK1和IKKε对于乳腺癌细胞和其他肿瘤细胞迁移和转移的促进作用,提示二者在作为抑制肿瘤转移潜在靶标方面存在极大的可能性。在分子机制探讨层面,我们利用多组学分析,发现TBK1和IKKε可能从转录水平和自身酶活性水平影响肿瘤细胞的多角度生物学行为,进而发现TBK1可能通过TBK1-AMPKα-Rac1/Cdc42轴调控肿瘤细胞的迁移能力,而IKKε则可能通过调控ERK1/2的活化和EMT影响肿瘤细胞迁移能力。我们的创新点可能在于发现TBK1和IKKε虽然作为结构类似、天然免疫调控功能类似、促进肿瘤转移功能类似的蛋白激酶,却通过不同的分子机制发挥促进肿瘤细胞体外迁移和体内转移的效应。我们的研究初步证实TBK1和IKKε的抑制可能作为防治肿瘤转移的潜在策略,具有重要的实际价值和临床意义。我们利用多组学数据进行分子机制的探索也可能为类似研究提供有益的实践经验参考。我们的研究也存在尚未解决的科学问题:TBK1和IKKε是否在其他临床肿瘤标本中存在异常表达和活化?TBK1具体通过什么机制抑制了AMPKα的活化?AMPKα具体如何调控的Rac1/Cdc42的活化状态?IKKε如何调控EMT的过程?是否存在其他分子机制参与调控TBK1和IKKε介导的肿瘤细胞迁移能力改变?TBK1和IKKε是否可以影响肿瘤免疫微环境的重塑导致肿瘤转移?这些科学问题尚待于未来的进一步研究。