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目的:通过长链非编码RNA(lnc RNA)介导咖啡因削弱电针镇痛效应的机制研究,明确咖啡因削弱电针镇痛效应;以lnc RNA及其调控靶基因为切入点,探讨咖啡因削弱电针镇痛效应机制,筛选针刺镇痛中对咖啡因响应的基因,以咖啡因摄入为依据,指导临床针刺治疗,并为针灸个体化治疗方案提供依据,为针灸的精准治疗提供了初步研究方向。方法:1.使用PL-200热刺痛仪对实验用C57BL∕6J小鼠进行热痛阈的筛选,剔除痛阈>20s及<10s者,随机分入空白组、模型组、模针+含咖啡因咖啡组及模针+脱咖啡因咖啡组四组。2.右后足注射完全弗氏佐剂(CFA)复制炎症痛模型,造模成功后第3天对针刺组进行足三里电针治疗,每日1次,5次为一个疗程,共治疗两个疗程,疗程间休息2天;咖啡组每天夜间饮用咖啡,白天停止饮用;非咖啡组同样方法饮用矿泉水;非电针组每天同样时间同样方法捆绑固定相同时间;各组每日相同时间进行热痛阈测定。3.取模针+含咖啡因咖啡组及模针+脱咖啡因咖啡组实验动物下丘脑并提取RNA,通过lnc RNA-seq高通量测序,以log2差异倍数的绝对值大于或等于1,且差异检验的Probability值大于或等于0.8作为筛选标准,筛选差异表达的lnc RNAs;以log2差异倍数的绝对值大于或等于1,且P值小于0.05作为筛选标准,筛选差异表达的m RNAs。4.应用MEM数据库、碱基互补配对方法、皮尔森(pearson)相关系数计算预测差异表达的lnc RNA的靶基因;针对差异表达的lnc RNA的靶基因,应用DAVID数据库进行基因聚类(GO与pathway)分析,构建lnc RNA-m RNA共表达网络;应用CIS/TRANS分析,明确lnc RNA在染色体上调控关系;采用Cytoscape构建TF-lnc RNA-靶基因网络关系。结果:1.咖啡因削弱电针镇痛效应结果显示:炎症痛模型复制成功后,热痛阈明显降低;模型+电针+脱咖啡因咖啡组两个疗程针刺治疗后热痛阈与模型组相比有明显差异(P<0.01);而模型+电针+含咖啡因咖啡组两个疗程针刺治疗后热痛阈无明显变化,与模型组比较无显著差异(P>0.05);模型+电针+脱咖啡因咖啡组每次治疗后热痛阈与模型+电针+含咖啡因咖啡组比较有明显差异(P<0.01)。2.lnc RNA高通量测序结果显示:模型+电针+脱咖啡因咖啡组与模型+电针+含咖啡因咖啡组比较共存在38个显著差异表达lnc RNA分子,其中21个表达上调,17个表达下调;共存在49个显著差异表达m RNA分子,其中19个上调,30个下调。3.MEM数据库预测已知lnc RNA(Gm20388,Numb,Ndufa5,Ppp1r1b,Rps26,Ndufa4,Atp5j2,Atp5e,Rps6)潜在靶基因:Rragc、Drd1a、Gpr6、Rybp。4.通过DAVID数据库对已知lnc RNA进行整体GO和Pathway注释,统计分析结果显示:GTP酶的调控、神经营养因子信号通路、MAPK信号通路、趋化因子信号通路可能与lnc RNA介导咖啡因削弱电针镇痛效应相关。5.皮尔森系数计算新预测lnc RNA(NONMMUG017325.1,54709)具有较高相关性的共表达m RNA:Gabrg1、Ikzf4、Pdap1。6.顺式调控元件(cis-regulatory element,CIS)确定了8个差异表达的lnc RNA(Ttr,Fam117b,Arhgap39,Ndufa5,Hba-a2,Atp5j2,Ndufc1,Atp5e)可能在染色体上的具有调控关系,其中Atp5j2,Atp5e具有共表达基因:Ppp4r1l-ps、Gm14393、Pdap1。7.lnc RNA CIS调控靶基因整体GO及Pathway分析结果显示:补体通路、T细胞激活过程共刺激信号、Erk1/Erk2 MAPK信号通路可能参与了咖啡因削弱电针镇痛效应。8.反式调控元件(Trans-act factor,trans)确定了差异lnc RNA Fam117b、NONMMUG017315.1、Ppp1r1b、RPS26、54709 trans调控转录因子:AP-2、T-Ag、AP-1、TFIID、MLTF、PEBP2、SIF、Sp1、GCF、APRT、Pu F、GATA-1、CTF、Ikzf4。9.Cytoscape构建了Ikzf4(TF)-RPS26(lnc RNA)-Gabrg1(m RNA)以及Ikzf4(TF)-54709(lnc RNA)-Gabrg1(m RNA)的三元相互调控网络。结论:1.电针具有镇痛效应,而同时摄入咖啡因则削弱电针镇痛效应。2.下丘脑中差异表达lnc RNA Gm20388,Numb,Ndufa5,Ppp1r1b,Rps26,Ndufa4,Atp5j2,Atp5e,Rps6,NONMMUG017325.1,54709可能参与咖啡因削弱电刺镇痛效应。3.下丘脑中差异表达lnc RNA可能通过神经营养因子信号通路参与咖啡因削弱电针镇痛效应。4.TF-lnc RNA-靶基因互相调控的三元网络:Ikzf4(TF)-RPS26,54709(lnc RNA)-Gabrg1(m RNA)可能参与了咖啡因削弱电针镇痛效应。