【摘 要】
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鸡球虫病是危害全球养鸡业最为严重的禽类疾病之一,每年给全球养鸡业造成巨大的损失。子孢子入侵宿主细胞是建立感染的第一步,也是防治球虫病的最佳时期,了解子孢子入侵宿主细胞后发生的抗球虫免疫反应可以进一步认识感染球虫后免疫系统的运行,为鸡球虫病的防治提供指导。本研究优化柔嫩艾美尔球虫子孢子提纯技术,将原代鸡胚肾细胞（CEK细胞）作为柔嫩艾美尔球虫（E.tenella）的宿主细胞,建立细胞模型,观察E.t
【基金项目】
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国家现代农业产业技术体系专项（CARS-41）； 江苏现代农业产业技术体系建设专项（JATS[2021]449）； 江苏高校优势学科建设工程（PAPD）；
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鸡球虫病是危害全球养鸡业最为严重的禽类疾病之一,每年给全球养鸡业造成巨大的损失。子孢子入侵宿主细胞是建立感染的第一步,也是防治球虫病的最佳时期,了解子孢子入侵宿主细胞后发生的抗球虫免疫反应可以进一步认识感染球虫后免疫系统的运行,为鸡球虫病的防治提供指导。本研究优化柔嫩艾美尔球虫子孢子提纯技术,将原代鸡胚肾细胞（CEK细胞）作为柔嫩艾美尔球虫（E.tenella）的宿主细胞,建立细胞模型,观察E.tenella在CEK细胞中的发育情况,研究子孢子入侵宿主细胞后发生的免疫反应,具体结果如下:（1）柔嫩艾美尔球虫子孢子提纯方法的优化使用1.0 mm玻璃珠和1.4 mm玻璃珠的球虫卵囊破壁率显著高于0.5 mm玻璃珠（P＜0.05）,表明直径1.4mm或者1.0mm的玻璃珠均是破碎球虫卵囊壁时一种较好的选择。D组（0.5%胰酶-10%新鲜鸡胆汁）和F组（10%新鲜鸡胆汁组的子孢子）出囊率极显著高于E组（0.5%胰酶-0.5%牛胆盐）（P＜0.01）,D组消化效果优于F组,选择0.5%胰酶-10%新鲜鸡胆汁作为孢子囊的消化液。G2漏斗-G3漏斗的子孢子回收率达到31.10%,与G3漏斗相比,子孢子回收率提高了 28%。（2）柔嫩艾美尔球虫在CEK细胞中的体外培养在CEK细胞内能够观察到E.tenell从子孢子发育成卵囊的完整过程。24 h观察到滋养体;72 h观察到观察到第一代裂殖体;120 h观察到第二代裂殖体;144 h观察到球虫卵囊。（3）柔嫩艾美尔球虫子孢子感染CEK细胞后细胞内4种细胞因子mRNA水平的分析分别设置空白组与感染组,运用qPCR技术检测细胞内与E.tenella感染相关的4种细胞因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）的mRNA水平,其中在子孢子感染后3h和9h时,感染组IL-6、IL-8及IL-1β的mRNA水平极显著高于空白组（P＜0.01）;在感染后12 h时,IL-1β和TNF-α的mRNA水平极显著高于空白组（P＜0.01）;在感染后24h时,TNF-α的mRNA水平极显著高于空白组（P＜0.01）。（4）柔嫩艾美尔球虫子孢子感染CEK细胞后细胞上清液中4种细胞因子浓度的分析分别设置空白组与感染组,运用酶联免疫检测法（ELISA）检测细胞上清液中与E.tenella感染相关的4种细胞因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）浓度。在感染后3h时,感染组IL-6、IL-8及IL-1β的浓度极显著高于空白对照组（P＜0.01）;在感染后9h时,与空白组相比,感染组IL-6及IL-1β的浓度极显著上升（P＜0.01）,IL-8浓度显著上升（P＜0.05）;在感染后12 h和24 h时,与空白组相比,感染组TNF-α的浓度极显著上升（P＜0.01）,IL-8浓度显著上升（P＜0.05）。（5）柔嫩艾美尔球虫子孢子感染CEK细胞后细胞上清液中抗氧化指标的分析与空白组相比,感染组CAT活性在子孢子感染后的3 h、9 h和12 h时极显著下降;空白组SOD活性在3 h时显著高于感染组（P＜0.05）,空白组SOD活性在9 h时极显著高于感染组（P＜0.01）;感染组ROS浓度在3 h和9h时极显著高于空白组（P＜0.01）;与空白组相比,感染组NO浓度在3 h时显著高于空白组（P＜0.05）,感染组NO浓度在9h时极显著高于空白组（P＜0.01）。综上所述,本研究发现E.tenella子孢子能够在CEK细胞内完成从子孢子发育成卵囊的完整过程;CEK细胞在应答E.tenella子孢子感染时,会释放各种细胞因子,抵抗球虫损害。本研究进一步加深了对宿主抵抗球虫感染的免疫机制及宿主与球虫之间相互作用机制的了解,为体外研究鸡球虫感染后相关细胞因子的表达提供了基础,同时也为球虫病的防治提供技术支撑。
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