【摘 要】
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目的:探讨miRNA-382-5p在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)NB4细胞分化中的影响及其分子机制。方法:1.采用ATRA(1umol/L)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)NB4细胞和非急性早幼粒细胞白血病(no-APL)HL-60、THP-1细胞分化,蛋白免
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目的:探讨miRNA-382-5p在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)NB4细胞分化中的影响及其分子机制。方法:1.采用ATRA(1umol/L)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)NB4细胞和非急性早幼粒细胞白血病(no-APL)HL-60、THP-1细胞分化,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PTEN及粒系分化标志物CD11b的蛋白质水平。2.运用TargetScan和PicTar软件预测miR-382-5p的靶基因。脂质体转染miR-382-5p的模拟剂(mimics)和特异性抑制剂(inhibitors)至NB4细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-382-5p和PTEN的表达水平。3.采用脂质体转染的方法,将携带有miR-382-5p结合位点以及结合位点突变的PTEN荧光素酶质粒和miRNA-382-5p的模拟剂(mimics)共同转染至人胚肾293T细胞。采用荧光素酶报告基因实验检测miR-382-5p对PTEN转录活性的影响4.构建过表达PTEN的慢病毒载体,分别感染NB4、HL-60和THP-1细胞。流式细胞术检测细胞周期和髓系分化标志(CD11b、CD14、CD15),间接免疫荧光检测PML与PTEN的细胞定位和表达。结果:1.蛋白质免疫印迹和实时荧光定量PCR结果显示,ATRA能够诱导NB4、HL-60和THP-1细胞的分化,但只在NB4细胞中发现ATRA能够下调miR-382-5p的表达。2.NB4细胞中,miR-382-5p能够在mRNA和蛋白水平抑制PTEN的表达,抑制miR-382-5p则能恢复PTEN的表达。TargetScan和PicTar软件预测miR-382-5p的靶基因可能是PTEN。双荧光素酶报告基因实验的结果表明,miR-382-5p可显著抑制PTEN基因的转录活性。3.PTEN过表达能够促进ATRA诱导的NB4细胞分化,但HL-60和THP-1细胞则无明显变化。PTEN还能增强NB4细胞对生理浓度ATRA的敏感性,并且促进核体构成蛋白PML、p53、HIPK2的表达,恢复PML核体的表达。4.MiR-382-5p/PTEN通过细胞周期蛋白CyclinD1和细胞周期G1期,影响细胞周期进而调控细胞分化。结论:1.MiR-382-5p靶向肿瘤抑制因子PTEN抑制ATRA诱导的NB4细胞分化。2.PTEN促进ATRA诱导的APL细胞的分化,并且增加细胞对生理浓度ATRA的敏感性。3.MiR-382-5p/PTEN通过细胞周期蛋白CyclinD1和细胞周期G1期,影响细胞周期进而调控细胞分化。4.过表达PTEN促进核体构成蛋白PML、p53、HIPK2的表达,进而恢复PML核体的表达。
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