VSIG4,又称作CRIg,是一种I型跨膜分子,属于免疫球蛋白超家族成员,含有典型的B7家族的特征。其最先是作为免疫球蛋白超家族的Z39Ig基因被克隆出来,序列一致性的程度和在染色体的定位证实Z39Ig即为人VSIG4。VSIG4分子和许多免疫球蛋白家族成员一样有胞外的典型的Ig样区,人VSIG4存在两种变异体形式,一种是VSIG4L,编码区全长1200bp,胞外区编码IgV和IgC两个结构域;另一种为VSIG4S,其编码区全长918bp,胞外区只编码IgV结构域,其它区域则与VSIG4L完全相同,即仅较VSIG4L仅缺少了IgC的编码区。人VSIG4L即为Z39Ig。鼠VSIG4分子仅有一种形式,结构和人VSIG4S一样,均缺乏胞外区的IgC结构域。人和鼠的VSIG4基因都位于X染色体上hephaestin和moesin基因编码区之间q12上。VSIG4的mRNA主要表达在胎盘、胎儿组织及成人的肝、肺等组织,其分子主要表达在由单核细胞来源的巨噬细胞上,而在单核细胞中几乎没有表达,同时在炎症部位的巨噬细胞,或活化后的巨噬细胞上VSIG4则呈现表达下降的趋势。在外周血中B细胞、T细胞、NK细胞及粒细胞均检测不到VSIG4的表达。先前的研究已经发现VSIG4是一种新发现的巨噬细胞上的补体受体,可结合补体C3的降解片段C3b和iC3b,对于病原体的吞噬其重要作用。而近来有研究发现VSIG4还是一种新的B7家族相关分子,并证实了VSIG4有抑制T细胞活化的作用。由于人VSIG4是新认识的分子,且对于其在T细胞免疫调节方面的相关研究材料很少,为了对该分子进行深入研究其生物学效应及作用机制。本研究旨在分别克隆人VSIG4基因两种不同变异体(VSIG4L和VSIG4S),并建立VSIG4的基因转染细胞株、制备VSIG4-Fc融合蛋白、且以VSIG4的基因转染细胞株作为免疫原免疫小鼠,研制获取鼠抗人VSIG4单克隆抗体,并以表达人VSIG4分子的基因转染细胞、VSIG4-Fc融合蛋白及抗人VSIG4单抗等为手段,研究揭示人VSIG4分子的生物学特性及其对T细胞共抑制作用的效应与方式。第一部分人VSIG4基因的克隆、基因转染细胞株的建立及其生物学功能的初步研究【目的】克隆人VSIG4基因编码区全长基因,分别构建含有人VSIG4基因两种不同变异体(VSIG4L和VSIG4S)的重组逆转录病毒载体,获得稳定表达VSIG4L和VSIG4S基因的细胞并初步研究其对T细胞的共刺激作用。【方法】从人正常肺cDNA文库中扩增出VSIG4L和VSIG4S的全长基因,并分别克隆入T载体中,双酶切后装入逆转录病毒载体pEGZ–Term中,与辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T制备含有重组病毒的培养上清,以其培养上清感染L929细胞72h后,经Zeocin筛选出稳定表达VSIG4L或VSIG4S分子的L929细胞株及293T细胞株;采用RT-PCR、Western-blot和流式细胞仪等分析鉴定VSIG4分子的表达;采用MTT和ELISA初步观察VSIG4基因转染细胞对T细胞增殖及IL-2分泌的影响。【结果】成功克隆出VSIG4L和VSIG4S全长基因,构建了含人VSIG4L基因和VSIG4S基因的重组逆转录病毒载体,并获得含有VSIG4L基因和VSIG4S基因的重组病毒,筛选并鉴定获得能稳定高表达人VSIG4L和VSIG4S膜型分子的L929及293T的转基因细胞;初步检测该转基因细胞具有体外抑制T细胞增殖和IL-2分泌的作用。【结论】成功建立了可稳定高表达人VSIG4L和VSIG4S膜型分子的基因转染细胞,为研制抗人VSIG4单克隆抗体提供了有效的免疫原,也为进一步研究VSIG4分子对T细胞抑制作用提供了实验材料。第二部分人VSIG4-Fc融合蛋白的制备、纯化【目的】获取稳定表达人VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc融合蛋白基因转染细胞株并制备纯化其融合蛋白【方法】采用PCR法从pMD19-T-VSIG4L和pMD19-T-VSIG4S中扩增出人VSIG4L和VSIG4S基因的胞外段序列,从pMD18-T-hIgG1Fc中扩增出人IgG1 Fc恒定区序列,将VSIG4和Fc顺次连接插入逆转录病毒载体pEGZ-Term,用脂质体法与两个辅助病毒载体共转染293T包装细胞,用含病毒颗粒的培养上清反复感染CHO细胞,以Zeocin筛选,流式细胞术测定GFP报告基因表达,获取能稳定分泌人VSIG4-Fc蛋白的基因转染细胞,并以RT-PCR和Dot-blot分析融合蛋白表达情况。基因转染细胞经无血清培养后,收集的上清经超滤浓缩后以Protein G柱纯化,再经Western blot鉴定其抗原结合特异性。以流式细胞技术测定融合蛋白和人T细胞的结合情况。【结果】成功构建了pEGZ-Term-VSIG4L-Fc及pEGZ-Term-VSIG4S-Fc重组逆转录病毒载体,并筛选获得了能稳定分泌VSIG4L-Fc及VSIG4S-Fc蛋白的CHO基因转染细胞株;流式细胞术显示GFP报告基因得到了较高的稳定表达,RT-PCR和Dot-blot分析可分别检测出扩增的VSIG4 ECD和HuFc特异性片段和所分泌的目的蛋白。Western blot鉴定了纯化得到的VSIG4L-Fc及VSIG4S-Fc融合蛋白,且纯化后的融合蛋白能够与T细胞表面的未知受体结合。【结论】建立了可稳定表达人VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc融合蛋白的基因转染细胞CHO/VSIG4L-Fc及CHO/VSIG4S-Fc细胞,并纯化得到它们的融合蛋白,为进一步研究VSIG4分子对T细胞抑制作用提供了实验基础。第三部分鼠抗人VSIG4单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究【目的】研制鼠抗人VSIG4单克隆抗体,为探讨人VSIG4分子的表达特性及其介导的负性信号对人T淋巴细胞抑制作用的效应与方式提供必备的物质手段。【方法】以高表达人VSIG4L分子的基因转染细胞L929/VSIG4L为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,利用B淋巴杂交瘤技术,将免疫小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞株SP2/0融合,以VSIG4L和VSIG4S的基因转染细胞为抗原筛选阳性细胞;经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,获得特异分泌鼠抗人VSIG4分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用细胞核染色体计数、Ig亚型快速定性试纸法、竞争结合抑制以及Western blot等试验,对获得的杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行生物学特性的鉴定;用间接免疫荧光法初步分析单抗对不同来源人肿瘤细胞株及巨噬细胞的结合反应。【结果】成功获得3株持续、稳定分泌鼠抗人VSIG4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2H4、9A7和9D5。经过快速定性试纸分析显示,3株单抗轻链均为κ链,重链均为IgG1亚类;间接免疫荧光标记和流式细胞术分析单抗2H4和9A7均可以和VSIG4L和VSIG4S结合,9D5仅能和VSIG4L结合,Western blot显示9A7均可以和VSIG4L和VSIG4S结合,9D5仅能和VSIG4L结合,2H4均未见特异性阳性条带。竞争结合抑制实验显示3株抗体间均不产生竞争作用。对mAb生物学特性的研究结果表明,3株mAb均能识别巨噬细胞以及Jurkat、THP-1、H446等肿瘤细胞株表面的VSIG4分子。【结论】成功获得3株稳定分泌特异性鼠抗人VSIG4单抗的杂交瘤细胞株,且它们识别不同的抗原表位,为揭示VSIG4分子的表达特性、深入探讨VSIG4对T细胞抑制的调节作用及信号机制提供了必要的物质手段。第四部分人VSIG4分子对T细胞的共刺激效应的研究【目的】利用研制获得的人VSIG4基因转染细胞、融合蛋白及抗人VSIG4单克隆抗体等为手段,探讨人VSIG4分子对T淋巴细胞共抑制作用的方式与效应。【方法】免疫磁珠分离纯化T细胞及CD4+、CD8+ T细胞作为效应细胞,以抗CD3激发型单抗刺激,联合或不联合抗人CD28单抗,从而模拟提供T细胞活化信号,同时采用表达膜型VSIG4L和VSIG4S分子的基因转染细胞、VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc融合蛋白及鼠抗人VSIG4单克隆抗体等,通过流式细胞术、MTT法和ELISA等方法分别测定或分析它们对T淋巴细胞活化、增殖及IL-2产生的抑制作用。【结果】1.以VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc为干预因素,它们对T细胞的增殖均较对照组有抑制作用(P<0.05),且与PD-L1-Fc抑制T细胞增殖效果相仿(P>0.05);在不同活化信号刺激下,VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc也均能抑制T细胞的增殖。且VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc间均没有明显统计学差异。2.以表达膜型VSIG4L和VSIG4S分子的基因转染细胞为干预因素,它们对CD4+、CD8+ T细胞及总T细胞的增殖均较对照组有明显抑制作用;对CD4+ T细胞IL-2的分泌也均有明显抑制作用;VSIG4L和VSIG4S的基因转染细胞间没有明显统计学差异。3.以抗CD3单抗激发T细胞增殖,以VSIG4基因转染细胞进行抑制,加入单抗2H4、9A7和9D5观察它们对其的阻断效应,MTT检测结果显示,单抗9A7能一定程度地阻断VSIG4L和VSIG4S介导的对T细胞的抑制作用,但2H4和9D5的阻断效应与IgG对照组没有统计学差异。4.用抗CD3单抗刺激T细胞增殖,VSIG4L-Fc阻断T细胞增殖,在加入不同浓度的外源人IL-2后,发现T细胞增殖明显增强,VSIG4L-Fc对T细胞的抑制作用近乎消失,并且在不同浓度的VSIG4L-Fc抑制时,其效果亦是如此。【结论】VSIG4分子可以明显抑制T细胞增殖和IL-2的分泌,且其VSIG4L和VSIG4S对T细胞抑制效应相仿,单抗9A7可以一定程度阻断此效应,并且这种抑制效应可以被外源的IL-2消除。