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经皮腔内冠状动脉成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）是治疗冠心病的有效手段之一，其在临床的应用显著降低了冠心病事件的发生率和死亡率，使该类患者院内救治成功率大大提高，但术后六个月内再狭窄的发生率高达30％-50％，这严重影响了治疗的远期疗效。许多学者致力于防治再狭窄的基础和临床研究，但到目前为止尚未取得明显进展。再狭窄的发生机制目前尚未十分清楚，但近年来的研究普遍认为PTCA术后，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）在中层增殖并通过细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解迁移至内膜而形成新生内膜是再狭窄发生的重要机理之一。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是近年来发现的一类Zn2+依赖性并以ECM成分为水解底物的内肽酶所组成的蛋白酶超家族，研究发现MMPs与ECM降解及VSMC增殖和迁移有着密切关系，在再狭窄的发生、发展过程中起重要作用。目前中药 浙江大学博士学位论文对VSMC分泌MMP活性的调节作用尚未见报导。本实验以培养的SD大鼠VSMC为研究对象，观察了中药黄茂对大鼠VSMC e的MMP－2活性的影响并探讨其可能的作用机理。 第一部分 黄蔑对血管平滑肌细胞分泌基质金属蛋自酶毛活性的影响研究目的：佣u观察黄蔑注射液对培养的SD大鼠VSMC分泌的MMP－二活性的抑制作用 及对细胞培养液上清中一氧化氮（Nitric Oxide，NO）水平的作用，并了解是否存在 量效和时效关系。方 法：组织贴块法培养SD大鼠VSMC；兔疫组化染色法鉴定VSMC；Zymography检 测VSMC分泌的MMP－2活性；硝酸还原酶法测定细胞培养液上清中NO水平。所 有培养液均含 0．4InM L精氨酸。每组 nL。结 果：在一氧化氮合成前体一L－精氨酸存在的情况下，0．snd，5 t，50mp／Inl的黄 蔑注射液分别刺激 VSMC 24h，VSMC的 MMP－2活性分别为 sl．75土6．40％，67．00土 11．75％，52．75ill．18％，与对照组（100％）比较显著升高（P＜0．05，n＝4），细胞培养 上清中的NO浓度u为sl．82土13．19 p、120．57土29．85…叽几、185．46士37．23 …叽几，较对照组（15．32士4．38 IJMILlJMIL）明显升高汐＜0．05，11＝4)；黄蔑注射液 5仰卯M 分别刺激VSMC 0，6，12，24h后，VSMC的 MMP－2活性分别为 96．sl士5．31％，78．78土 6．56％，74．13土5．39％，66．00士6．07％，与对照组各相应时点 MMP－2活性（100％，96．78 f4．78％，97．59i4．54％，103．po士3．36％）相比较，除刺激即刻无显著差异外 （ cd．05， n＝4），余均较对照组明显下降（P＜O．05，n叫；细胞培养上清中的＊O浓度分别为14．28 13．69 p、36．72士6．94 p、69。6319．54 p、125．6ill4．sl p，与对照 组各相应时点门．93土4．02…脱、12．66士5．41 w、14．25士5．87 w、12．90土 3．31 p）相比较，除刺激即刻无显著差异外(P ＞（刀5，n＝4），余均较对照组明显升 高（P＜O刀5刀二斗）。 2 浙江大学博土学位论文结 论：黄茂注射液在体外抑制SD大鼠VSMC分泌MMP－2的活性，且此作用呈药物 浓度和时间依赖；黄蔑注射液刺激VSMC后，培养液上清中的NO水平明显上升， 此作用也呈药物浓度和时间依赖。 第二部分 黄芙对血管平滑肌细胞分泌基质金属 蛋白酶工活性影响的作用机制研究目的：进一步观察NO在黄蔑注射液抑制SD大鼠VSMC N的MMP－2活性中的作 用，并探讨可能的机制。方 法：体外培养SD大鼠VSMC，Zylllography检测VSMC分泌的MMP－2活性；Western 印迹杂交法检测 MMP－2及诱导型一氧化氮合酶（WOS）蛋白表达；RT－PCR检测 MMP－ZW表达。无血清培养 24小时后，VSMC继续以 10％FBS DMEM培养， 并分成 4组（n＝4）：A组：对照组；B组：0．SIYI．．m．ru－－氨基肌 C组：sgh黄茂注 射液；D组：swt黄蔑注射液＋0．5111．si－－－－氨基肌。各组继续培养24小时，所有 培养液均含 0．4InM e精氨酸。结 果：B组 MMP－2活性为 105．2514．19％，略高于 A组（100％），但无统计学差异（ ＞0刀5，n ＝4＝4），C组MMP－2活性（62．75土8．88％）显著高于A组(P＜0．01，n＝勺，D组 MMP－2活性（82．00土 5．60％）较 C组增高（＜0．of，if＝4），但仍明显低于对照组（P ＜0．of，if＝4）。B组的 MMP－2蛋白表达为 105．73f41．9％，略高于 A组（100％），但无 统计学差异（＞0．05，if＝4），C组 MMP－2蛋白表达（60．34 f 7．09％）显著高于 A组（P ＜0．0且刀叫，D组MMP－2蛋白表达门正＊6土8．59％）较C组增高（P＜0．0回，n＝4），但仍 明显低于对照组(＜0．