背景和目的:肥胖的发生率逐年增多,肥胖症易与糖尿病、血脂异常、冠心病、高血压病等一起发生,是糖尿病、心血管疾病的独立危险因素,已严重危害人体健康,目前其发病机制尚未明了。1994年瘦素的发现揭示了控制食欲和能量代谢平衡的神经内分泌机制,使肥胖研究进入了新阶段[1]。然而瘦素治疗肥胖的效果并不理想,其原因是肥胖症者大多不缺乏瘦素,而是高瘦素血症,存在瘦素抵抗。研究证实中枢瘦素抵抗是导致肥胖症的关键[2-3],而外周组织特别是胰岛β细胞瘦素抵抗可能在肥胖者高胰岛素血症发生中起重要作用[3-4],但β细胞瘦素抵抗的发生机制及其影响因素目前尚不清楚。研究揭示,胰岛β细胞的瘦素受体特异性基因敲除小鼠出现了典型的高胰岛素血症及胰岛素抵抗[4],从遗传学角度证实胰岛β细胞的瘦素信号缺失在肥胖引起的高胰岛素血症中具有至关重要的作用。然而,瘦素受体的基因突变在典型的肥胖人群中并不常见,因此并不是大部分肥胖人群中出现瘦素抵抗的主要机制。近年研究发现,肥胖同时也是机体的一种慢性炎症状态,大量炎症细胞浸润脂肪组织,产生TNF-α、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)、白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)等众多细胞因子,与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病等的发生密切相关[5-11]。但炎症因子是否干扰瘦素抑制胰岛素分泌的功能,诱导胰岛β细胞的瘦素抵抗,从而在肥胖引起的高胰岛素血症的产生中发挥重要作用,迄今鲜有报道,其详细的分子机制更缺乏系统的研究。为此,我们在培养的胰腺癌细胞系INS-1E和大鼠原代胰岛中,观察了TNF-α和瘦素单独或联合作用对胰岛β细胞前胰岛素原基因的表达、葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose stimulated insulin secretion, GSIS)、β细胞的增殖与凋亡等功能的影响;进一步从瘦素受体表达水平、瘦素受体后细胞内信号传导途径的关键分子分析了TNF-α对瘦素信号通路的影响;结合重组DNA技术克隆了人瘦素受体启动子,直接在基因转录水平观察了TNF-α对瘦素受体启动子活性的影响。材料与方法:1.用Ⅴ型胶原酶消化及人淋巴细胞分离液分离纯化大鼠原代胰岛。2.在含5.5mmol/L葡萄糖培养基中培养传代的大鼠胰腺癌细胞系(INS-1E)和大鼠原代分离的胰岛,经生理浓度瘦素(0.5nmol/L)或TNF-α(2ng/ml)及高浓度瘦素(10nmol/L)与TNF-α(20ng/ml)单独及联合处理48小时后,在基础葡萄糖(3.3mmol/L)或高糖(16.7mmol/L)中分别刺激一小时,放免法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能;3. RT-PCR与real-time PCR检测用胰岛素原(proinsulin)的mRNA表达水平。4.放射免疫(RIA)测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能,同时结合超声破胞方法通过RIA检测细胞内胰岛素含量。5. MTT实验检测瘦素和TNF-α对INS-1E细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI结合流式细胞仪检测瘦素和TNF-α对INS-1E细胞凋亡的影响。6. Western Blot结合RT-PCR与real-time PCR检测TNF-α对瘦素受体mRNA及蛋白水平的影响。7.采用重组DNA技术克隆人瘦素受体基因启动子-荧光素酶报告基因载体。8.报告基因分析法观察TNF-α对瘦素受体启动子活性的影响。结果:1.首先在培养的胰腺癌细胞系INS-1E和大鼠原代胰岛中,观察了TNF-α和瘦素单独或联合作用对胰岛β细胞前胰岛素原基因的表达、胰岛素合成与GSIS功能、β细胞的增殖与凋亡的影响。1)葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(GSIS)表明,高浓度的瘦素(10nmol/L)和TNF-α(20ng/ml)单独作用均可抑制INS-1E细胞的GSIS功能;瘦素和TNF-α联合作用与瘦素单独作用相比对GSIS功能的抑制效果减弱。这一现象在大鼠原代胰岛上得到了验证。2) RT-PCR与real-timePCR的结果均显示:瘦素和TNF-α都可以抑制proinsulin的mRNA水平;联合时显示TNF-α具有拮抗瘦素抑制胰岛素原基因表达的作用。胞内胰岛素含量检测结果进一步在蛋白水平证实TNF-α具有拮抗瘦素抑制胰岛素蛋白表达的作用。3) MTT实验也证实了瘦素和TNF-α可以剂量依赖性地抑制β细胞的增殖。Annexin V-FITC/PI凋亡检测结果进一步证实了高浓度的瘦素和TNF-α均可促进β细胞的凋亡。但二者联合作用时,β细胞凋亡率没有进一步增加。据此,我们推测瘦素和TNF-α在诱导凋亡的功能上也存在拮抗。2.为了阐明TNF-α拮抗瘦素抑制胰岛素合成与分泌的分子机制,我们采用RT-PCR、real-timePCR和Western Blot检测了瘦素长型受体OBRb在β细胞上的表达;Western Blot检测了瘦素受体后的信号传导分子STAT3的活化;RT-PCR和real-timePCR检测了瘦素的主要负性调节因子SOCS-3的表达。结果显示:TNF-α是通过抑制瘦素长型受体OBRb在β细胞上的表达,抑制了瘦素受体后JAK/STAT3的信号传导,从而拮抗瘦素在β细胞上的生物效应的。这可能是肥胖诱导瘦素抵抗产生的机制之一。3.由于TNF-α能抑制OBRb的mRNA水平,我们进一步克隆了瘦素受体的启动子报告基因载体,通过报告基因分析,直接从转录调控水平观察TNF-α对瘦素受体基因表达的影响。采用基因克隆技术成功构建了三个不同长度的瘦素受体的启动子报告基因载体(LR1 pGL-3296/+105 ,LR2 pGL-2376/+105与LR3 pGL-1824/+105)。利用瞬时转染及报告基因分析技术观察发现,TNF-α可以同时下调人H-LEPR基因启动子报告基因载体LR1、LR2和LR3的转录活性。但详细的转录抑制机制尚待进一步阐明。结论:1.在胰岛β细胞中,炎症因子TNF-α对瘦素抑制胰岛素合成、葡萄糖刺激的胰岛素分泌及细胞凋亡等功能均有拮抗作用。2. TNF-α是通过抑制瘦素长型受体OBRb在β细胞上的表达,抑制了瘦素受体后JAK/STAT3的信号传导,从而拮抗瘦素在β细胞上的生物效应的。3.瘦素受体的启动子活性分析显示, TNF-α可以下调人H-LEPR基因启动子活性,说明TNF-α可以从转录水平抑制瘦素受体的表达。详细的作用机制尚待进一步阐明。上述结果提示肥胖者体内升高的TNF-α可能通过抑制OBRb基因表达,干扰瘦素/JAK/STAT3的信号传导通路,拮抗瘦素对胰岛素合成与分泌的抑制作用,导致β细胞产生瘦素抵抗。这些作用提示炎症因子在肥胖伴随的高胰岛素血症及葡萄糖代谢紊乱的发生中可能具有重要作用。