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来自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶Ⅱ(SCRⅡ)能催化2-羟基苯乙酮(HAP),合成(S)-苯乙二醇(PED),但反应需要烟酰胺类辅酶NADPH的参与。由于辅酶价格较高、稳定性差、难以重复利用,导致手性催化合成成本较高,限制了其在手性催化中的应用。本研究运用重叠延伸PCR技术,构建了SCRⅡ、葡萄糖脱氢酶突变体Ala258Phe/GDH和木聚糖酶XYN2三个酶的共表达和融合表达体系,以实现辅酶循环的高效手性合成。两种重组菌以2-羟基苯乙酮为底物,木聚糖为辅助底物,高效合成(S)-苯乙二醇,本研究成功将木聚糖代谢介导的辅酶再生体系引入手性合成中,为木聚糖作辅助底物促进氧化还原酶介导的手性催化奠定了研究基础。具体研究内容如下:(1)以pET-SCRⅡ、pET-A258F/GDH、pET-XYN2为模板,利用重叠延伸PCR方法,将SCRⅡ、A258F/GDH和XYN2基因分别通过SD-AS、GGGGS序列连接,构建了pET-S-SD-AS-G-SD-AS-2、pET-S-SD-AS-2-SD-AS-G、pET-G-SD-AS-S-SD-AS-2、pETG-SD-AS-2-SD-AS-S和pET-S-L-G-L-2、pET-S-L-2-L-G、pET-G-L-S-L-2、pET-G-L-2-LS共表达和融合表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21,结果表明在共表达重组菌株E.coli/pET-G-SD-AS-S-SD-AS-2中,三个基因同时表达,分子量大小分别为33、30和22 kDa。在融合表达菌株E.coli/pET-S-L-G-L-2和E.coli/pET-G-L-S-L-2中,实现了三个基因的融合表达,融合蛋白的分子量为85 kDa。融合表达蛋白镍离子亲和层析柱纯化后,经蛋白电泳,显示为单一条带。(2)共表达菌株E.coli/pET-G-SD-AS-S-SD-AS-2中SCRⅡ、A258F/GDH和XYN2的酶活分别为0.85、1.36、55.33 U/mg;在融合表达菌株E.coli/pET-S-L-G-L-2和E.coli/pET-G-L-S-L-2中,SCRⅡ、A258F/GDH和XYN2的酶活分别为为4.58、3.71和188.49 U/mg和2.43、6.54、231.78 U/mg;SCRⅡ、A258F/GDH和XYN2三个酶单独表达时酶活分别为8.56、14.58和695.63 U/mg,均高于共表达、融合表达时三个酶活。此外,研究了三个酶的最适pH和最适温度,及pH和温度稳定性。SCRⅡ、A258F/GDH和X YN2分别在pH值为7.0、6.5和5.0时表现出最高的催化活性,SCRⅡ和A258F/GDH有较广的pH稳定范围,SCRⅡ在pH 5.0–8.0,A258F/GDH在pH 6.0–9.0范围内相对稳定,酶活均保持在60%以上,而XYN2的pH稳定性相对较窄,pH值在4.0–6.0范围内相对稳定;SCRⅡ、A258F/GDH和XYN2分别在35、50和50℃条件下表现出最高催化活性,三种酶均有较好的温度稳定性。(3)确定了共表达和融合表达菌株不对称转化反应的最佳反应条件:共表达菌株E.coli/pET-G-SD-AS-S-SD-AS-2,催化6 g/L 2-羟基苯乙酮,在35℃,pH 6.5,底物与辅助底物比例为2:1条件下,反应28 h,产物(S)-苯乙二醇的得率最高为98.3%,光学纯度为100%;融合表达菌株E.coli/pET-S-L-G-L-2、E.coli/pET-G-L-S-L-2,催化6 g/L 2-羟基苯乙酮,在35℃,pH值为7.0,底物与辅助底物比例为1:1和、2:1条件下,反应26 h,产物得率达到最高,分别为98.8%和95.6%,产物光学纯度均为100%。相比于SCRⅡ单基因表达的重组菌株E.coli/pET-SCRⅡ,共表达和融合表达菌株催化获得产物得率明显提高,同时反应时间缩短近一倍。