猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一种猪的全身急性热性败血性传染病,给全世界养猪业带来的经济损失高达数亿元。CSFV属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）,是一种单股正链有囊膜的RNA病毒。囊膜糖蛋白E0是CSFV糖蛋白中最具免疫原性的蛋白之一,能够诱导机体产生中和抗体,是建立CSFV血清学检测方法的优质选择。衣壳蛋白Core（C）是CSFV编码的第一个结构蛋白,调控病毒转录、泛素化和增殖,在CSFV感染宿主细胞中起着重要作用。本研究首先将E0蛋白进行了原核表达和纯化,建立了能够检测E0抗体的间接ELISA方法。该方法不仅能对临床血清样本进行快速精准检测,同时也能对E2亚单位疫苗产生的抗体和野毒感染的抗体初步进行鉴别诊断,为我国的猪瘟防控、净化乃至根除提供技术支撑;其次,将C蛋白进行了原核表达和纯化,免疫小鼠后制备了单克隆抗体,为后续更深入地研究CSFV感染机制提供生物材料,有利于病原学研究。1.检测CSFV E0抗体ELISA方法的建立与应用首先,根据CSFV石门株E0全长基因序列,设计一对特异性引物,经PCR扩增得到目的基因后,克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-E0。经测序鉴定后将其转化至表达宿主菌（BL21）中,加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG,37℃5 h诱导表达。纯化后的蛋白经Western blot鉴定发现与标签抗体和CSFV标准阳性血清均能发生反应,证明免疫原性良好。其次,将E0蛋白作为捕获抗原倍比稀释后包被酶标板,通过优化实验确定了最佳抗原包被浓度、最佳一抗和二抗稀释倍数及一抗反应时间,并确定了阴阳性判定标准以及鉴定了稳定性和特异性。结果显示:最佳抗原包被浓度为2 μg/mL;最佳一抗和二抗的稀释倍数为1:100和1:40000,孵育时间分别为30min和50min;组间与组内实验变异系数均小于10%;无交叉反应性,特异性良好。用建立的方法与商品化试剂盒同时检测206份临床血清,发现阳性和阴性符合率分别为96.55%和84.21%,总体符合率为94.17%。表明建立的ELISA方法具有良好的敏感性、稳定性和符合率,可用于临床样本的检测。最后,用本研究建立的ELISA方法和商品化E2抗体ELISA试剂盒对临床免疫E2亚单位疫苗的85份血清样本进行比较检测,结果显示商品化试剂盒检测阳性率为91.76%,本方法检测阳性率为10.59%,表明本研究建立的检测E0抗体的ELISA方法可初步用于猪瘟净化的鉴别诊断。2.CSFVC蛋白的原核表达与纯化及单克隆抗体的制备与鉴定首先,根据CSFV石门株C全长基因序列,设计一对特异性引物,经PCR扩增得到目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组质粒pET-28a-C。经测序鉴定后转化至表达宿主菌（BL21）中,经0.1 mmol/L的IPTG 37℃诱导5h。诱导并纯化后的C蛋白经Western blot鉴定发现与标签抗体和CSFV标准阳性血清均发生反应,显示了该蛋白具有良好的免疫原性。其次,纯化的重组C蛋白与弗氏完全佐剂及不完全佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,制备了单克隆抗体。Western blot结果证明单抗能特异性识别重组目的蛋白和感染CSFV的细胞裂解物,说明该单抗具有良好的免疫反应性,且特异性实验证实无交叉反应性。最后,激光共聚焦显微镜显示细胞株06A3E和06A4E所分泌的单抗均能特异性识别细胞感染中的CSFV,为后续CSFV深入研究提供生物材料。