研究背景及目的慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种以持续存在的呈进行性发展的气流受限为特征的常见疾病,伴有气道和肺对有害颗粒或气体所致慢性炎症反应的增加。气道、肺实质及肺血管的慢性炎症是COPD的特征性改变,多种炎症细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞等)参与了COPD的发病过程。越来越多的研究资料表明,严重的COPD患者存在发生侵袭性肺曲霉病(IPA)的高风险。曲霉是一种条件致病菌,对于免疫功能正常的人,曲霉孢子吸入人体后可以被天然免疫系统清除；但是免疫功能低下的病人,曲霉孢了吸入在肺部后,可以在肺部大量繁殖,在一定条件下导致肺部的侵袭性感染并可随血循环播散到其他器官,甚至可能导致死亡。研究资料表明,COPD是ICU患者曲霉感染重要的危险因素。有学者认为大剂量使用糖皮质激素、合并基础疾病、反复运用广谱抗生素、肺功能III级以上、营养不良等因素可能增加COPD患者曲霉感染的风险,但这种观点缺乏大量相关的研究资料来佐证。而本实验室前期的临床研究资料表明,COPD患者稳定期全身使用糖皮质激素、住院期间使用三种以上抗生素、以及抗生素使用时间大于10d是发生IPA的相关独立危险因素。COPD患者曲霉易感性增加的具体机制尚不清楚,可能与机体防疫功能的减退——尤其是与巨噬细胞吞噬功能的减退有关。国内外大量的研究表明,长期吸烟可能影响AM (alveolar macrophages,AM)功能,导致肺的免疫功能受损,从而使COPD患者呼吸系统细菌定植以及肺部感染发生率增高。肺泡巨噬细胞是机体的第一道防线,在清除烟曲霉分生孢子的过程中扮演着重要的角色。巨噬细胞要通过吞噬作用与杀灭作用才能将曲霉孢子清除,吞噬作用作为清除过程的首要步骤,就显得尤为重要。巨噬细胞发挥吞噬作用需依赖其表面的模式识别受体(Pathogen recognition receptors, PRRs)对曲霉孢子的识别。在所有相关的PRRs中,与曲霉分生孢子关系较为密切的是Toll样受体(Toll Like Receptors, TLRs)其中,TLR2是TLRs中与烟曲霉关系最为密切的一种。它能识别烟曲霉PAMP,如β-葡聚糖、角质素、肽聚糖、甘露糖蛋白及其他细胞壁成分,通过MyD88髓样分化蛋白或非MyD88转接蛋白,激活NF-κB等转录因子,从而引起多种细胞因子——如IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α等的表达分泌,促进巨噬细胞的杀菌和吞噬活性。Meier等研究证实,小鼠巨噬细胞识别曲霉孢子依赖TLR2。进一步的体外研究提示,巨噬细胞通过TLR2等识别曲霉孢了,引起促炎因子的产生与释放,同时募集中性粒细胞至感染部位。本研究采用烟熏十内毒素滴入的方法建立COPD大鼠模型,并通过病理米评价模型。在成功建立COPD大鼠模型的基础上,我们研究了COPD大鼠肺泡巨噬细胞对曲霉孢子吞噬功能的变化、分泌炎症因子的特点及可能的调控机制；从基因水平和蛋白水平研究了COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2的表达情况。研究方法：1慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及鉴定1.1COPD大鼠模型的建立：采用烟熏+内毒素滴入的方法,动物每天置于烟室内三次,每次45分钟,COPD组向烟室内注入香烟烟雾,对照组注入空气,共30天(第9、19天除外)。第9、19天试验组气道内注入浓度为1mg/mL内毒素200μL,对照组滴入等量生理盐水。1.2COPD大鼠模型的鉴定：第30天将大鼠处死,支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞分类计数；取下右肺,经多聚甲醛固定、病理切片、HE染色,用病理评分的方法对模型进行鉴定。1.3数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料以x±s表示,服从正态分布的方差齐性计量资料均数比较采用两独立样本t检验分析,方差分析不齐时采用Welch近似t检验,以a=0.05为统计学差异检验水准。2慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬细胞分泌和吞噬功能的变化2.1COPD大鼠模型的建立同上。2.2肺泡巨噬细胞的分离培养及鉴定：对大鼠进行肺泡灌洗,将收集的BALF离心后获得的细胞置于RPMI1640培养液中,37℃,5%CO2孵育2h后去掉未贴壁细胞,并利用CD68单抗对贴壁细胞进行免疫荧光检测,呈绿色荧光即为肺泡巨噬细胞。2.3培养上清炎症因子的测定：同上法分离大鼠肺泡巨噬细胞并培养2h,收集培养上清,采用ELISA测定肺泡巨噬细胞培养上清炎症因子TNF-α、MIP-2、IL-10及IL-1β的表达。2.4肺泡巨噬细胞对曲霉孢子的吞噬率及吞噬指数的测定：BALF离心后获得的细胞以1×106/mL接种到六孔板,37℃,5%CO2孵育2h后去上清,加入曲霉孢子混悬液20μL,补足培养体积至1mL,37℃,5%CO2孵育2h,取出盖玻片行PAS染色,计数吞噬率及吞噬指数。吞噬率=(吞噬孢子的巨噬细胞数/计数巨噬细胞总数)×100%；吞噬指数=吞噬孢子的总数/吞噬孢子的巨噬细胞数。2.5肺泡巨噬细胞NF-κB的表达检测：提取肺泡巨噬细胞胞浆、胞核蛋白,运用、Vestern blot技术测定NF-κB的表达。2.6数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料以x±S表示,服从正态分布的方差齐性计量资料均数比较采用两独立样本t检验分析,方差分析不齐时采用Welch近似t检验,以α=0.05为统计学差异检验水准。3慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬细胞TLR2的表达3.1COPD大鼠模型的建立同上。3.2肺泡巨噬细胞的分离培养及处理：将收集的BALF离心后获得的细胞置于RPMI1640培养液中,37℃,5%CO2孵育2h后去掉未贴壁细胞,然后于各组大鼠肺泡巨噬细胞中分别加入Pam3CYK4(每孔加1ug,浓度1mg/mL)和曲霉孢子(每孔加2.5×106个孢子)及1mL生理盐水,各自培养4h后收集细胞。3.3肺泡巨噬细胞TLR2的表达：提取细胞总蛋白,运用qRT-PCR及Westernblot技术,检测大鼠肺泡巨噬细胞TLR2的表达。3.4数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(X+S)表示,主效应与交互效应采用析因分析,单独效应采用单因素方差分析,以a=0.05为统计学差异检验水准。结果1慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立1.1成功建立COPD模型：COPD组肺组织镜下可见支气管纤毛柱状上皮呈锯齿样增生增厚,纤毛倒伏,上皮脱落,支气管腔内中性粒细胞及黏液蓄积,管壁结缔组织增生,平滑肌增厚,可见单核细胞和淋巴细胞浸润,支气管周围可见淋巴小结。肺泡结构紊乱,肺泡壁变薄、断裂,肺泡腔扩大,部分融合成较大的囊腔。COPD组支气管炎症评分显著高于对照组(4.33+1.16vs.1.33±0.58,P=0.016)。COPD组平均内衬间隔(MLI)显著高于对照组[(168.77+11.35)μmvs.(93.61±4.16)μm,P=0.000)]。BALF细胞分类计数：COPD组BALF中白细胞总数较对照组显著升高[(2.34+0.15)×108/L vs.(1.72±0.30)×108/LP=0.002],分类以肺泡巨噬细胞及中性粒细胞为主[(72.0±±2.2)%和(18.3±±8.3)%]。2慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬细胞分泌和吞噬功能的变化2.1细胞培养上清中TNF-α、MIP-2、IL-10、IL-1p的浓度：COPD组肺泡巨噬细胞培养上清中TNF-α、MIP-2的浓度显著高于对照组(均为P=0.000),IL-10、IL-1p浓度在两组间无统计学差异(均为P>0.05)。2.2肺泡巨噬细胞对曲霉孢子的吞噬率及吞噬指数：对照组肺泡巨噬细胞对曲霉孢子的吞噬率显著高于COPD组(P=0.000)；而对照组与COPD组肺泡巨噬细胞对曲霉孢子的吞噬指数差异无统计学意义(P=0.053)。2.3NF-κB p65的表达：COPD组肺泡巨噬细胞胞浆NF-κB p65蛋白的表达水平显著低于对照组(P=0.011),而胞核的表达水平则显著高于对照组(P=0.003)。3慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬细胞TLR2的表达3.1大鼠肺泡巨噬细胞TLR2基因表达水平3.1.1经析因分析显示,对照组与COPD组相比,COPD组肺泡巨噬细胞TLR2基因转录强度高于对照组,差异具有统计学意义(F=680.60,P=0.000)。三个处理因素相比,曲霉孢子对大鼠肺泡巨噬细胞TLR2基因转录强度影响最大,Pam3CYK4次之,生理盐水对大鼠肺泡巨噬细胞TLR2基因转录强度影响最小,差异具有统计学意义(F=353.21,P=0.000)。烟雾和生理盐水、曲霉孢子或Pam3CYK4存在交互效应(F=17.79,P=0.000),即COPD组分别滴加生理盐水、曲霉孢子或Pam3CYK4后,肺泡巨噬细胞TLR2基因转录强度的差异比对照组大；可认为烟雾可影响经生理盐水、曲霉孢了或Pam3CYK4刺激的大鼠肺泡巨噬细胞TLR2基因的表达水平。3.1.2基础状态下,COPD组肺泡巨噬细胞TLR2基因转录强度低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4后,COPD组肺泡巨噬细胞TLR2基因转录强度均低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.000)3.1.3滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2基因转录强度均高于基础状态,差异具有统计学意义(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的对照组肺泡巨噬细胞TLR2基因转录强度也均高于基础状态,差异具有统计学意义(P=0.000)。3.2大鼠肺泡巨噬细胞TLR2蛋白表达水平3.2.1经析因分析显示,对照组与COPD组相比,COPD组肺泡巨噬细胞TLR2蛋白表达水平高于对照组,差异具有统计学意义(F=349.58,P=0.000)。三个处理因素相比,曲霉孢子对大鼠肺泡巨噬细胞TLR2蛋白表达水平影响最大,Pam3CYK4次之,生理盐水对大鼠肺泡巨噬细胞TLR2蛋白表达水平影响最小,差异具有统计学意义(F=77.08,P=0.000)。烟雾和生理盐水、曲霉孢子或Pam3CYK4存在交互效应(F=18.07,P=0.000),即COPD组分别滴加生理盐水、曲霉孢子或Pam3CYK4后,肺泡巨噬细胞TLR2蛋白表达水平的差异比对照组大；可认为烟雾可影响经生理盐水、曲霉孢子或Pam3CYK4刺激的大鼠肺泡巨噬细胞TLR2蛋白的表达水平。3.2.2基础状态下,COPD组肺泡巨噬细胞TLR2蛋白的表达水平低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4后,COPD组肺泡巨噬细胞TLR2蛋白的表达水平均低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.000)。3.2.3滴加曲霉孢了或Pam3CYK4的COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2蛋白的表达水平均高于基础状态,差异具有统计学意义(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的对照组肺泡巨噬细胞TLR2蛋白的表达水平也均高于基础状态,差异具有统计学意义(P=0.000)结论本实验采用烟熏+内毒素气道滴注的方法成功建立了COPD大鼠模型,其表现为以中性粒细胞、巨噬细胞为主的慢性炎症；肺泡巨噬细胞NF-κB p65活化,TNF-α、MIP-2等促炎因子表达水平增加,吞噬功能减退,此可能与长期的烟雾暴露导致的肺泡巨噬细胞TLR2不能正常上调相关。