基于纳米复合材料的生物传感器的构建及其在诺如病毒检测中的应用

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诺如病毒(Norovirus,No V)是病毒性急性胃肠炎的主要病原体之一。No V是一种单股(+)RNA病毒,基因组全长7.6 kb,根据编码主要衣壳蛋白核酸序列的同源性,可分为7个基因群(GI-GVII),其中GI、GII和GIV可以感染人类。不同基因群还可再分为多种基因型。全球调查发现,诺如病毒最常见的基因型为GII型,占90%以上,在GII基因型中,GII.4基因型为优势流行株。目前用于No V检测的方法主要有电镜法、免疫学法、反转录聚合酶链反应和实时荧光定量PCR等,这些方法或具有灵敏度低,特异性差的缺点或具有操作复杂,仪器昂贵的缺点。因此,急需开发一种灵敏、快速、操作简便的诺如病毒检测方法。特异性肽是利用噬菌体展示技术筛选出来的,能够特异性识别目标分析物的多肽,由于其表面具有丰富的氨基酸残基,可通过化学结合或物理吸附与材料结合。适配体是单链DNA/RNA寡核苷酸,由随机序列核酸文库产生,对靶分子具有高结合亲和力和特异性,与抗体相比,适配体具有稳定性好、生产成本低、应用通用性强、体积小、易于修饰和操作、免疫原性低等优点。为此,本文基于特异性识别诺如病毒的特异性结合肽(Norovirus Peptide,Noro Pep)、适配体(Aptamer,Apt)和抗体等三种识别元件,两两组合构建了三种诺如病毒生物传感器:第一种,利用多层碳化钛@银@适配体纳米复合材料(F-Ti3C2Tx@Ag-Apt)作为探针材料,联合肽/金@还原氧化石墨烯@单层碳化钛/玻碳电极材料(Pep/Au@r GO-MXene/GCE)对病毒的捕获作用,最终获得性能优越的诺如病毒电化学生物传感器。该传感器具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的优点,对No V GII.4和GII.3基因型均具有较好的检出效果,对GII.4的最低检出限(LOD)为0.33 copy/m L。第二种,利用肽/金@黑磷@碳化钛/玻碳电极材料(Pep/Au@BP@Ti3C2/GCE)对病毒的捕获作用,以甲苯胺蓝(TB)为电活性物质,联合适配体@金@锌铁氧@共价有机框架纳米酶材料(Apt@Au@Zn Fe2O4@COF)对TB的富集和催化作用,构建得到诺如病毒电化学传感器。该传感器具有特异性高、灵敏度高、稳定性强、检测限低的优点,对No V GII.4基因型的LOD为0.003 copy/m L。第三种,我们发现适配体@金@锌铁氧@共价有机框架(Pep@Au@Zn Fe2O4@COF)具有较好的过氧化物酶活性,在H2O2存在的条件下,可以将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)氧化为蓝色物质。基于这一原理,我们利用诺如病毒抗体作为捕获探针,构建了简单、灵敏快速的诺如病毒比色免疫传感器。而且相比于天然酶,纳米酶具有稳定性高,不易变性,成本低,易储存,易获得等优势,因此所构建的传感器具有操作简单,特异性强,灵敏度高,成本低,可批量检测的优点,对GII.4的LOD为0.33 copy/m L。本研究同时利用诺如病毒特异性结合肽、适配体和抗体三种识别元件,结合新型纳米复合材料,构建出诺如病毒电化学生物传感器和比色免疫传感器,这些传感器均不需要提取核酸,直接检测病毒粒子,大大提高了检测效率,简化了检测流程。同时本研究所构建的传感器检测成本低,操作简单,无需昂贵的仪器,有望应用于诺如病毒的即时检测分析中。
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