大肠杆菌热稳定肠毒素(ST)是产毒性大肠杆菌引起腹泻的主要致病因子之一,具有生物毒性,而且免疫原性很弱.霍乱弧菌引起腹泻的主要致病因子是其产生的毒素(CT),霍乱毒素的B亚单位(CTB)无毒性,且有很强的免疫原性,因此常用作半抗原的载体.我们选取ST的抗原相关片段(十肽)基因与CTB基因的5端重组,为了减少CTB在空间结构上对ST的影响,在CTB和ST之间加上适当长度的Linker,并对重组蛋白的结构进行了预测.在载体pUC19的基础上成功构建了表达重组载体pMCST1和pMCST2,使ST与CTB在同一个阅读框中,实现了CTB与ST的融合重组.两者不同的是pMCST1使单拷贝的ST与CTB重组,pMCST2使又拷贝的ST与CTB重组.重组蛋白在大肠杆菌DH5α中高效表达.由于融合蛋白CTB-ST1和CTB-ST2是在CTB自身的启动子和相关调控元件的作用下表达,不需要pUC19上的LacZ启运子,因而融合蛋白的表达不需要IPTG的诱导.研究发现,适当的低温诱导可以促进重组蛋白的分泌表达.在30℃的条件下培养有重组载体转化的大肠杆菌DH5α,融合蛋白高效表达.用免疫单扩散法和ELISA的方法测定蛋白表达量,结果有80﹪以上的重组蛋白分泌到细胞外的培养基中,为蛋白的纯化带来了方便.SDS聚丙烯酰胺凝胶电沪分析证实重组蛋白的分子量是正确的.CTB-ST1约为14KD,CTB-ST2的分子量为15.1KD.用神经节苷脂GM1包板，GM1-ELISA分析表明，重组蛋白仍具有与GM1的结合能力和CTB的抗原性.将抗CTB抗体偶联到CNBr-activated Sepherose 4B制成亲和层析柱，对重组蛋白进行亲和层析，获得了高纯度的重组蛋白.对获得的重组蛋白的毒性分析，发现重组蛋白在该实验剂量的范围内无毒：当喂饲乳鼠的重组蛋白剂量达到1000ng时（1000ng的CTB-ST1含有100ng的ST;1000ng的CTB-ST2含有200ng的ST）仍未表现出毒性.用获得的重组蛋白免疫小鼠（KM）、可以诱导产生高滴度的抗CTB和抗ST的血清，表明重组蛋白具有CTB和ST的免疫原性和抗原性，在该本实验剂量范围内（以ST的含量计算，高剂量组为6ug/只，低剂量组为3ug/只）用于免疫小鼠是安全的.该论文为进一步研究抗细菌性腹泻的多价疫苗打下基础.