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目前,还未见到有关鸭疫里黙氏杆菌(RA)表面抗原D15截短蛋白的深入研究报道。本试验通过对本实验室在NCBI GenBank注册的Riemerella anatipestifer D15基因(登录号为CP003787)进行了生物信息学分析,对D15基因N端的主要抗原域进行了克隆和原核表达、重组蛋白纯化和多克隆抗体制备、检测鸭疫里黙氏杆菌抗体的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立、RAD15截短蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定,结果如下：1.D15基因的生物信息学分析通过对D15基因及其编码蛋白的结构、抗原性、功能位点以及稀有密码子等进行了全面的生物信息学分析,结果显示RA D15基因包含2个保守结构域,与多种黄杆菌属同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性。其编码产物含有信号肽、1个跨膜区,可以定位于细胞外膜,抗原表位较多且在N端相对较多,不含有多个连续的稀有密码子。2.D15 N端基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备在上述分析基础上克隆了该基因并利用原核表达系统pET-28a(+),表达了部分ORF编码产物(完整ORF编码产物不表达),经SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小约为34 kDa, Western blot表明,表达产物可与兔抗RA全菌多克隆抗体发生特异性免疫反应。采用Ni-NTA琼脂糖凝胶层析柱纯化重组蛋白,免疫动物制备了RA tD15多克隆抗体,琼扩效价为1：16。凝集实验表明制备的抗血清能与RA CH-1株全菌发生特异性反应。3.检测鸭疫里然氏杆菌抗体的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立目前,还未见到通过建立构建重组tD15蛋白乳胶凝集试验来检测RA的研究报道。本试验采用Ni-NTA琼脂糖凝胶层析柱纯化pET-28a-tD15原核表达蛋白,以羧化乳胶为载体经化学交联法致敏乳胶,对致敏条件优化后的乳胶进行质量检测。结果显示在pH7.4的PBS缓冲液中,乳胶浓度为1%、蛋白质量浓度为0.225 mg/mL、偶联6h后制备的致敏乳胶凝集反应最好；致敏乳胶抗原无自凝现象；与鸭传染性肿头症、鸭病毒性肝炎、鸭流行性感冒、鸭大肠杆菌病、鸭沙门氏菌病,鸭病毒性肠炎阳性血清不发生凝集；批内重复、批间重复试验很稳定；阳性血清的敏感性为1：256。对比试验中建立的LAT方法与本实验室已建立的ELISA方法的符合率为80%,2种方法检测的结果基本一致。研究结果表明,乳胶凝集方法具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点,是一种适合基层兽医单位用于鸭疫里然氏杆菌(RA)血清抗体检测的新方法。4.D15截短蛋白的单克隆抗体的制备及初步鉴定制备抗RA tD15蛋白的单克隆抗体并对其特性进行鉴定。应用纯化复性的重组tD15蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合,应用有限稀释法筛选出抗RA tD15重组蛋白的阳性杂交瘤细胞株；采用腹水诱生法制备单抗腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体；采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞以及测定单克隆抗体的特性、效价及其相对亲和力。获得2株抗RA tD15蛋白的阳性杂交瘤细胞株,命名为4#、16#,2株细胞株经反复冻存复苏,体外传代仍能稳定分泌抗体；4#单克隆抗体属于IgG1,κ链；16单抗单克隆抗体属于IgG2b,κ链；4＃杂交瘤细胞培养上清效价为1：3200,腹水效价为1：12800,16杂交瘤细胞培养上清效价为1：6400,腹水效价为1：204800；2株单克隆抗体均能够识别大小约为34 kDa的蛋白,说明两种单克隆抗体是特异性识别tD15蛋白的抗体；两种单抗能够与鸭疫里黙氏杆菌全菌裂解蛋白发生特异性反应,而不与其他鸭源的病原体发生反应；测得其亲和常数分别为1.52×109 L/mol和1.0×1010 L/mol;两种单克隆抗体可能识别两种不同的抗原表位。RA tD15蛋白单克隆抗体的制备为进一步鉴定D15蛋白B细胞抗原表位、D15蛋白功能研究及建立鸭疫里然氏杆菌快速检测法提供了有效工具。