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喷司他丁(Pentostatin,PNT)为拟嘌呤核苷类抗生素,是高效的腺苷脱氨酶抑制剂,可用于治疗多种肿瘤方面的临床疾病。PNT合成方法主要包括化学合成法和生物合成法,相较于生物合成法,化学合成法不但成本高、反应条件苛刻且路线复杂,实施难度较大。而生物合成法的反应条件温和、绿色环保,可行性较强,但生物合成法最大的瓶颈是PNT产率较低。基于此,本论文主要利用代谢调控、常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)以及核糖体工程等策略诱变和选育高产PNT的突变株。构建了PNT合成关键基因AdaE和AdaJ的敲除株以及基因AdaA的过表达株。经LC-MS检测没有发现有PNT的产生,可能是基因敲除和过表达操作对基因簇本身调控机制带来了干扰,影响了PNT生物合成基因簇的表达。利用ARTP诱变选育PNT高产菌株。将Actinomadura sp.ATCC39365作为出发菌株,以致死率为考查指标,优化了ARTP的诱变条件,确定ARTP诱变最优条件为130w,12 SLM,200 s。筛选出遗传稳定性良好的菌株为Actinomadura sp.M-26(2.740mg/L),与出发菌株相比,PNT摇瓶产量提高了11.75%。利用核糖体工程技术选育具有单抗性的PNT高产菌株。首先,测定备用抗生素对野生型Actinomadura sp.ATCC39365的最小抑菌浓度和最佳筛选浓度。采用最佳筛选浓度获得一株抗Pen且遗传稳定良好的PNT高产菌株Actinomadura sp.M-65(3.298mg/L),与出发菌株Actinomadura sp.ATCC39365相比,PNT产量提高了34.5%;ARTP诱变选育出的Actinomadura sp.M-26经过Str抗性筛选得到一株稳定性较好的PNT高产菌株Actinomadura sp.MM-10(5.188 mg/L)与Actinomadura sp.M-26菌株相比PNT产量增加了89.34%,且与出发菌株相比摇瓶发酵PNT产量增加了111.58%。利用核糖体工程技术选育双重抗性PNT高产菌株。以PNT高产菌株Actinomadura sp.M-22、Actinomadura sp.M-26、Actinomadura sp.M-53和Actinomadura sp.M-65为出发菌株,再次经过抗性筛选得到6株PNT高产菌株,其中一株遗传稳定较好且产量较高突变株Actinomadura sp.MM-45(6.077 mg/L),在突变株Actinomadura sp.MM-65基础上PNT产量增加了84.15%,与出发菌株相比摇瓶发酵PNT产量提高了147.84%。突变株关键基因突变位点分析:使用Blast、Clustal X和SnapGene Viewer软件对分别6株Str抗性菌株和1株Gen抗性菌株的关键基因的突变位点分析发现:6株Str抗性菌株中有5株rspL基因的第28位的碱基A缺失,只有Actinomadura sp.MM-46的rspL基因没有发生突变,与已报道文献比较,可能是rspL突变引起了菌株对Str的抗性;6株Str抗性菌株中有5株菌株的rpoB基因发生了随机突变且突变位点较多,其中Actinomadura sp.MM-26没有发生突变,猜测PNT产量的提高与rpoB无关;6株Str抗性菌株的rsmG基因发生突变的主要位置有188位C缺失、193位C缺失和467位T替换C,可能rsmG基因上的突变也能使菌株获得Str抗性。1株Gen抗性菌株的rslF基因发生突变为175位T替换C及462位后插入碱基A,突变结果可能引起菌株获得Gen抗性。