间充质干细胞不仅具有干细胞的生物学特性,还能够通过旁分泌途径保护缺血组织。不少研究表明,外泌体是其旁分泌途径释放的主要生物成分,和干细胞具有相似的作用。同时,外泌体还具有免疫原性低、易取材、易储存与运输、不涉及伦理问题等优势。使用外泌体治疗心血管疾病能够大大降低异体干细胞移植带来的急性免疫排斥反应。因此,基于无细胞的外泌体替代疗法有望成为临床治疗缺血性血管疾病的一种有效策略。本研究中,我们发现人脐带间充质干细胞能够增强后肢缺血小鼠的血流恢复和运动功能。但是,间充质干细胞表达HLA-Ⅰ类抗原,因此仍然具有一定的免疫原性,这也是阻碍间充质干细胞发挥其有益作用的一个主要因素。我们构建了小鼠后肢缺血模型,并将来源于人脐带的间充质干细胞移植到小鼠的损伤部位,发现机体发生免疫排斥反应。当我们利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术敲除干细胞的B2M基因后,免疫荧光和流式检测发现,干细胞HLA-Ⅰ类抗原的表达受到抑制,细胞移植后机体内的免疫排斥反应也随之降低。最终,我们利用激光多普勒血流仪对小鼠的血流恢复情况进行检测,利用跑步机和抓力仪对小鼠的后肢运动功能进行检测,发现B2M敲除的干细胞比正常干细胞具有更好的修复效果。随后,我们对人脐带间充质干细胞和外泌体进行了 miRNA高通量测序,发现干细胞和外泌体均高表达miR-24,因此我们推测外泌体可能通过释放miR-24发挥调控作用。通过转染inhibitor和mimic对外泌体中miR-24的表达水平进行改造,发现过表达miR-24的外泌体具有更显著的保护作用。双荧光素酶报告基因显示,Bim是miR-24的下游靶分子,外泌体中的miR-24通过抑制Bim蛋白的表达,抑制肌肉细胞的凋亡,进而增强后肢运动功能。研究报道,外泌体中除了富含miRNA,还含有circRNA。circRNA 呈闭合的环状结构,核酸酶对其不容易识别,因此它们比miRNA可能更为稳定。除此之外,相比miRNA,circRNA的生物学功能更为多样,因此具有更广泛的应用前景。我们发现外泌体中可以表达circRNA,其中circPWWP2A的表达量相对比较丰富。对小鼠缺血前后的circRNA表达水平进行测序,发现circPWWP2A在小鼠缺血后显著下调。进一步实验发现,外泌体可以通过携带circPWWP2A促进后肢缺血的修复。我们发现外泌体中的circPWWP2A释放到损伤部位后,可以通过靶向miR-29b,调控CDK6/Rb1/AMPKα2信号通路,进而抑制缺血环境下NLRP3等分子的表达,降低缺血组织中的炎症反应,最终促进急性缺血后肢的恢复。我们的研究发现,异体间充质干细胞移植仍然具有引发机体内急性免疫排斥反应的风险,干细胞来源的外泌体和母本细胞具有相似的生物学作用,因此可将外泌体应用于下肢缺血性疾病的治疗。外泌体中含有大量非编码RNA,外泌体主要通过释放这些功能性分子到损伤部位发挥调控作用。我们发现外泌体可以通过释放miR-24抑制肌肉细胞的凋亡,进而促进损伤组织修复。我们使用电转染的方法,向外泌体中转染miR-24 mimic,获得了高表达miR-24的外泌体,为外泌体内部分子的改造提供借鉴;除了 miR-24,外泌体中还含有circPWWP2A,circPWWP2A充当miR-29b的分子海绵,进而抑制缺血组织中NLRP3炎性小体的激活和IL-1β、IL-18的释放,降低缺血组织中的炎症反应,最终促进缺血后肢的恢复。