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目的:通过观测麝香黄芪复方滴丸联合间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）移植对脑缺血再灌注（middle cerebral artery obstruction/reperfusion,MCAO/R）大鼠模型血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）形态学、通透性以及转运体P-gp/OATP的影响,探究麝香黄芪复方滴丸联合MSCs移植对MCAO/R大鼠模型的作用及其机制,不仅能为临床治疗急性缺血性脑卒中提供实验基础,还可为开发促进干细胞靶向给药的中药调节或增强制剂奠定药理学基础。方法:1实验动物与分组选用无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级,雄性Sprague Dawley（SD）大鼠408只,体重190-200g,随机分为假手术组58只、MCAO/R组（模型组）70只、麝香黄芪复方滴丸治疗组（中药组）70只、MSCs移植治疗组（MSCs组）70只、麝香黄芪复方滴丸联合MSCs移植治疗组（联合组）70只和依达拉奉注射液治疗组（对照组）70只,共六组,且每组又根据取材时间的不同分为2天（day,d）组和5d组两个亚组。2实验给药麝香黄芪复方滴丸按生药量7.2g/（kg﹒次）加生理盐水配置成混悬液,给中药组及联合组分别按15m L/kg灌胃,假手术组、模型组及MSCs组分别灌胃生理盐水（15ml/kg）,每日1次;对照组按3mg/（kg﹒次）腹腔注射,在造模前3天开始给药,每日1次,直至取材结束。MSCs组和联合组在缺血2小时再灌注24小时后,采用尾静脉注射1ml含有1×10~6个MSCs的细胞悬液,假手术组、模型组、中药组及对照组注入等量生理盐水。3造模方法采用Zea-Longa线栓法改良制备MCAO/R大鼠模型。缺血再灌注2小时后,依据神经功能缺损评分选择纳入后续实验的大鼠。4相关指标观察及检测于造模后2d和5d时间点对各组大鼠分别进行:神经功能缺损评分;TTC染色观察脑梗死面积;HE染色观察各组大鼠脑组织病理形态的改变;免疫组化法（immunohistochemistry,IHC）观察各组大鼠脑组织AQP-4蛋白表达的变化;透射电子显微镜观察血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）超微结构的改变;干湿重法检测脑组织含水量;伊文斯兰（evens blue,EB）法检测BBB通透性;ELISA法检测脑组织中水通道蛋白4（aquaporin-4,AQP-4）、P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）和有机阴离子转运多肽（organic anion transporting polypeptide1a4,OATP1a4）的含量以及血清中P-gp和OATP1a4的含量;蛋白质印迹法（western blot,WB）法检测脑组织中AQP-4、P-gp和OATP1蛋白的表达。结果:1神经功能缺损评分于术后2d、5d对各组大鼠进行神经功能缺损评分,结果显示:假手术组大鼠神经功能缺损均为0分;与假手术组相比较,模型组大鼠神经功能缺损表现极其显著,有极其显著性差异（P＜0.001）;与模型组相比较,中药组、MSCs组、联合组、对照组大鼠神经功能缺损表现均显著改善,差异有显著性意义（P＜0.05）,其中联合组大鼠神经功能缺损改善最为显著,差异具有极其显著性意义（P＜0.001）。2 TTC染色结果在2d、5d两个取材时间点对各组大鼠脑组织进行TTC染色,结果显示:假手术组大鼠脑组织染色为均匀的红色,表示正常脑组织;其余各组大鼠脑组织均有红、白染色呈现,其中白色部分染色表示MCAO/R后的梗死区,且模型组脑梗死面积最为显著,证明本次实验MCAO/R大鼠模型制备成功。与模型组相比较,中药组、MSCs组、联合组、对照组的脑梗死面积均有显著改善,其中联合组脑梗死面积改善更加明显。3 HE染色结果观察2d、5d各组大鼠脑组织HE染色,结果显示:假手术组大鼠脑皮质结构清晰完整,神经细胞形态与结构完整、排列有序,胞质饱满,胞核居中,核仁清晰;与假手术组相比较,模型组大鼠脑皮质结构破坏,梗死周围脑水肿明显,梗死区神经细胞严重变性坏死且数量较多,细胞结构紊乱,胞质萎缩,胞核固缩、边界不清且染色加深,胞核周围出现大量空泡,呈“蜂窝样”改变;与模型组相比较,中药组、MSCs组、联合组、对照组的大鼠脑皮质形态结构均有不同程度的改善,水肿也有所减轻,坏死的神经细胞相对减少,胞质与胞核也均有不同程度的恢复,其中联合组改善和恢复较其他治疗组更加明显,部分神经细胞形态与结构已基本恢复,“蜂窝”现象显著减少,效果明显优于各药物单用治疗组。4 IHC法观察AQP-4表达结果观察2d、5d IHC检测各组大鼠脑组织AQP-4的表达结果显示:大鼠脑组织中AQP-4蛋白阳性表达呈棕黄色或棕褐色空泡状,表达主要分布于梗死区脑皮质周边、海马以及星形胶质细胞处。其中,假手术组大鼠脑组织AQP-4的阳性表达极其少见;与假手术组相比较,模型组大鼠脑组织中AQP-4阳性表达显著增多;与模型组相比较,中药组、MSCs组、联合组、对照组大鼠脑组织中AQP-4阳性表达均有不同程度减少,其中联合组大鼠脑组织AQP-4的表达较其他治疗组显著减少。5 BBB超微结构的变化通过透射电镜检测观察2d、5d各组大鼠脑皮质BBB超微结构显示:假手术组大鼠脑皮质BBB结构正常,脑毛细血管形态规则,基底膜基本连续完整,星形胶质细胞脚板、线粒体以及周细胞形态结构均正常,内皮细胞结构及连续性正常,内皮细胞间的紧密链接清晰完整可见;与假手术组相比较,模型组BBB结构破坏,基底膜连续性消失,毛细血管管腔因血管周围细胞水肿而变窄,内皮细胞有自噬小泡出现,内皮细胞间的紧密链接变得毛糙、开放、断续或消失,且电子密度降低;与模型组相比较,中药组、MSCs组、联合组、对照组大鼠脑皮质的BBB结构均有改善,基底膜连续性逐渐恢复,内皮细胞间紧密链接间隙变窄、连续性有所恢复,其中联合组BBB结构恢复程度以及紧密链接的改善,明显优于各药物单用治疗组。6脑组织含水量通过检测2d、5d各组大鼠脑组织含水量结果显示:与假手术组相比较,模型组大鼠脑组织含水量极其显著增加（P＜0.001）;与模型组相比较,中药组、联合组、对照组以及5d MCSs组脑含水量均显著降低（P＜0.05）,其中联合组大鼠脑含水量降低极其显著（P＜0.001）。7 BBB通透性通过检测2d、5d各组大鼠脑组织EB含量结果显示:与假手术组相比较,各时间点模型组大鼠脑组织EB含量非常显著增加（P＜0.01）;与模型组相比较,中药组、MSCs组、联合组、对照组脑EB含量均显著降低（P＜0.05）,其中5d联合组脑EB含量减轻极其显著（P＜0.001）。8 ELISA检测各组大鼠血清和脑组织中AQP-4、P-gp和OATP1a4的含量8.1 ELISA法检测血清中P-gp和OATP1a4的含量通过检测2d、5d各组大鼠血清中P-gp、OATP1a4的含量显示:与假手术组相比较,模型组大鼠血清中P-gp的含量极其显著增加（P＜0.001）,OATP1a4的含量显著降低（P＜0.05）;与模型组相比较,中药组、联合组、MSCs组、对照组大鼠血清中P-gp的含量均显著降低（P＜0.05）,OATP1a4的含量均非常显著增加（P＜0.01）,其中大鼠血清中P-gp的含量在5d联合组时降低极其显著（P＜0.001）,OATP1a4的含量在2d联合组时增加极其显著（P＜0.001）。8.2 ELISA法检测脑组织中AQP-4、P-gp和OATP1a4的含量通过检测2d、5d各组大鼠脑皮质中AQP-4的含量以及海马中P-gp、OATP1a4的含量,结果显示:与假手术组相比较,模型组大鼠脑皮质中AQP-4的含量极其显著增加（P＜0.001）,海马中P-gp的含量极其显著增加（P＜0.001）、OATP1a4的含量显著降低（P＜0.05）;与模型组相比较,中药组、联合组、MSCs组、对照组大鼠脑皮质中AQP-4的含量均显著降低（P＜0.05）,海马中P-gp的含量均显著降低（P＜0.05）、OATP1a4的含量均显著增加（P＜0.05）,其中脑皮质中AQP-4的含量在2d联合组降低极其显著（P＜0.001）,海马中P-gp的含量在5d联合组降低极其显著（P＜0.001）、OATP1a4的含量在2d联合组增加极其显著（P＜0.001）。9 WB法检测脑组织中AQP-4、P-gp和OATP1蛋白的表达通过检测2d、5d各组大鼠脑皮质中AQP-4蛋白的表达以及海马中P-gp、OATP1蛋白的表达,结果显示:与假手术组相比较,模型组大鼠脑皮质中AQP-4蛋白的表达显著升高（P＜0.05）,海马中P-gp蛋白的表达非常显著升高（P＜0.01）、OATP1蛋白的表达显著降低（P＜0.05）;与模型组相比较,脑皮质中AQP-4蛋白的表达除2d中药组无差异（P＞0.05）,其余各药物组均显著降低（P＜0.05）,且2d联合组降低极其显著（P＜0.001）,海马中P-gp蛋白的表达除2d MSCs组、对照组无差异（P＞0.05）,其余各药物组均显著降低（P＜0.05）,且5d联合组降低极其显著（P＜0.001）,OATP1蛋白的表达除2d对照组无差异（P＞0.05）,其余各药物组均显著升高（P＜0.05）,且2d联合组升高极其显著（P＜0.001）。结论:1麝香黄芪复方滴丸联合MSCs移植能显著改善大鼠脑缺血再灌注后的神经功能缺损症状,减轻脑组织病理损害,降低致残率,减少梗死率。2麝香黄芪复方滴丸联合MSCs移植可通过改善、修复BBB结构,下调AQP-4蛋白的表达,从而降低BBB通透性,减轻脑水肿。3麝香黄芪复方滴丸联合MSCs移植可通过降低P-gp蛋白的表达,升高OATP1a4蛋白的表达,促进药物及物质进出BBB,进而维持BBB内环境稳态,从而起到脑保护作用。4麝香黄芪复方滴丸联合MSCs移植具有协同增强抗脑缺血再灌注后脑水肿、BBB损伤的作用,其机制可能与调控AQP-4、P-gp、OATP1a4蛋白的表达有关。