甜菜红素诱导巨噬细胞系RAW264.7表型及生物学功能变化的研究

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甜菜红素是一种水溶性含氮色素,它是获得批准用于食品着色的天然食用色素,并且得到广泛应用。甜菜红素还有一定的医药保健价值,在抗疲劳、抗辐射、抑制脂质氧化、清除氧自由基等方面备受关注。有研究表明,甜菜红素通过作用于多种类型的细胞而表现出抗炎、抗氧化和抗癌的药理学作用。但甜菜红素对巨噬细胞的作用却鲜有报道。本研究拟对甜菜红素诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7表型及生物学功能的变化进行探讨。采用浸提法获取鸭跖草、白花蛇舌草、黄芪、半枝莲、蒲公英、白英、艾叶等7种植物的乙醇粗提物和红甜菜水提物。通过MTT法对RAW264.7细胞毒性进行筛选,确定对RAW264.7细胞毒性最弱的红甜菜提取物作为后续研究对象。采用大孔树脂吸附法纯化甜菜红素,通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)和高效液相色谱(HPLC)进行分析鉴定分子量和纯度。使用MTT法结合显微镜下观察提纯后不同含量的甜菜红素对RAW264.7细胞活力的影响,确定后续试验中甜菜红素采用的终浓度。采用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)和免疫荧光双染色技术检测代表巨噬细胞转录水平的和相关功能基因、蛋白质水平的表达量变化。最后,通过检测甜菜红素诱导RAW264.7细胞的吞噬、增殖、迁移和粘附能力,评估其生物学行为变化。结果表明:(1)D101大孔树脂分离纯化后的甜菜红素分子量为m/z 551.18,甜菜红素的纯度为71.9%。(2)使用浓度为300μM的甜菜红素处理RAW264.7细胞三天,细胞表现出活化的细胞形态。通过q RT PCR检测的最能代表巨噬细胞活化状态的六个基因中,筛选出了M1表型巨噬细胞标志物IL-1和TNF-α的表达量显著增高。为此,广泛检测了代表M1(CD86、CD11c、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CXCL2、CCR2、IL-6、IL-12α、IL-23α、IL-27、CSF3、CSF2、Nfκbia、NOS2和COX2)和M2(CD163、CCL22、CD206、CCL17、CCL24、Socs2、IL-13、IL-8和VEGFA)表型的基因。对甜菜红素刺激8h和24h的RNA样本进行分析,其中有14个表达上调基因特异于M1表型或参与M1表型转变。并通过免疫荧光双染色在蛋白质水平上进一步验证,代表M1表型的巨噬细胞标志物CD86和CCR2表达增加,而在基因表达量无变化的M2表型标记物CD68和CD163在免疫荧光双染色的实验中荧光信号均无明显改变。(3)甜菜红素诱导巨噬细胞生物学行为方面,表现为迁移和吞噬能力增强,增殖和粘附能力未有改变。结论:红甜菜提取物对巨噬细胞RAW264.7毒性最弱,大孔树脂纯化得到纯度为71.9%的甜菜红素。使用300μM甜菜红素诱导RAW264.7细胞三天,细胞表型向M1型转化,其特征是迁移和吞噬能力增强。
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