论文部分内容阅读
目的:SPC24是核分裂周期80（Nuclear Division Cycle 80,NDC80）复合物的亚基之一,它与其他三个蛋白（NUF2、NDC80和SPC25）共同参与了NDC80复合物的形成。NDC80复合物在NDC80-NUF2蛋白复合物的帮助下介导与纺锤体微管结合;SPC24-SPC25蛋白复合物将NDC80复合体锚定在内着丝点上,并且协调核纺锤体微管与动态的着丝点之间相互黏附,确保有丝分裂中染色体分离过程的精准。迄今为止,有研究报道发现基因SPC24在各种肿瘤中呈高表达水平,而其在前列腺癌（Prostatic Carcinoma,PCa）、良性前列腺增生（Benign Prostatic Hyperplasia,BPH）和前列腺炎中的影响还未见报道。本课题组拟通过研究SPC24基因在PCa、BPH和前列腺炎中的表达和探究SPC24及其相互作用体的联合诊断模型对PCa的诊断价值。为未来PCa的诊断及预后寻找新型有意义的生物标志物。方法:1.使用The Cancer Genome Atlas（TCGA,http://xena.ucsc.edu/public）公共数据库下载PCa所对应的RNA-seq数据来分析PCa样本和正常样本中SPC24（m RNA）的表达水平,运用独立样本t检验进行SPC24表达量与临床病理相关性的分析,利用Kaplan-Meier法和对数秩检验（Log-Rank）进行生存分析的讨论。2.临床上收集样本,借助实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（RT-q PCR）实验对各类{BPH、PCa及癌旁（Adjacent Tissues,AT）}样本中SPC24（m RNA）表达进行检测、借助蛋白印迹技术（Western Blot,WB）对PCa样本及AT样本中SPC24蛋白的表达进行检测;运用免疫组化（IHC）技术检测SPC24在各类（BPH、PCa、前列腺炎样本、AT和正常前列腺）样本中的表达差异,探究SPC24表达水平与BPH患者、PCa患者、前列腺炎患者临床病理特征及预后之间的关系。3.通过STRING在线分析软件（http://string-db.org/）检索SPC24相互作用基因,利用GO基因注释和KEGG通路分析对SPC24及其相互作用蛋白（NDC80、BUB1）进行分析。借助RT-q PCR实验技术验证BUB1、NDC80在PCa和AT中的m RNA表达水平。通过TCGA数据库中的m RNA数据（量化为RSEM）,建立两个联合诊断模型（SPC24+BUB1、SPC24+NDC80）。利用二元逻辑回归（Logistic）算法,对两个联合诊断模型在PCa中的的诊断效能进行ROC曲线分析。结果:1.TCGA数据库下载的550例前列腺样本m RNA表达数据,包括498例PCa样本及52例正常前列腺样本纳入研究。结果表明与正常组（正常前列腺样本）相比,PCa样本中的SPC24 m RNA表达明显高于正常组（P60岁）,Gleason评分较高（8-10）和PSA值较大（>0.1）的PCa患者中发现高表达的SPC24。在生存分析中SPC24表达量较高的患者OS较短,其AUC值为0.821（p<0.05）。2.IHC结果显示:PCa组与AT组相比,有37.14%（13/35）的PCa患者SPC24呈高表达,其余的呈低/阴性表达（P<0.0001）;BPH组与AT组相比,有27.5%（11/40）的BPH患者SPC24呈高表达,其余的呈低/阴性表达（P=0.001）;在前列腺炎组与正常组相比,有41.67%（5/12）的列腺炎患者SPC24呈高表达,其余的呈低/阴性表达（P=0.045）;而SPC24在AT样本（35/35）、正常样本（9/9）中显示出100%低/阴性表达（P0.05）。PCa患者SPC24的高表达与Gleason分期（Ⅳ+Ⅴ）有关（p<0.05）;BPH患者SPC24表达水平与民族、Cr Cl有关（P0.05）。WB实验表明:PCa样本的SPC24蛋白阳性率显著高于AT样本（P<0.05）。RT-q PCR分析:SPC24m RNA水平在PCa中较AT显著增高（8.43±3.00 vs 1.22±0.25,P<0.05）;在PCa中较BPH显著增高（8.43±3.00 vs 4.09±1.72,P<0.05）;在BPH中较AT显著增高（4.09±1.72 vs 1.22±0.25,P<0.05）。即SPC24 m RNA表达水平在PCa中最高,BPH中次之,AT中表达量最低,差异具有统计学意义。3.STRING数据库对SPC24及其相互作用蛋白（BUB1、NDC80）进行GO基因功能注释、通路富集分析,GO分析结果显示SPC24及其相互作用蛋白主要参与了细胞周期、细胞分裂过程以及细胞重要组分的形成,例如着丝点、细胞核、细胞质基质、细胞器等。通路分析中,SPC24及其相互作用蛋白参与姐妹染色体的分离、MAD2通路、细胞周期检查点、RHO家族的小GTP酶活性激活和信号转导等通路。RT-q PCR验证结果表明BUB1和NDC80的表达在PCa样本中的表达均高于AT样本,其结果表明SPC24及其相互作用体的m RNA表达一致,且与PCa患病率呈正相关（P<0.05）。ROC曲线结果显示:SPC24和BUB1联合诊断模型的敏感性（Sensitivity）是88.2%,特异性（Specificity）是80.8%,曲线下面积（Area Under Curve,AUC）是0.894;SPC24和NDC80联合诊断模型中,敏感性是84.7%,特异性是96.2%,AUC是0.905,即两个联合诊断模型的AUC均大于0.89（P<0.05）。结论:1.TCGA公共数据库及组织验证显示SPC24在前列腺癌组织中呈高表达。2.SPC24的高表达与前列腺癌患者的低生存期相关。3.SPC24在前列腺癌中的高表达与Gleason评分、t PSA有关;在前列腺增生样本中的高表达与民族、Cr Cl有关。4.联合诊断模型在前列腺癌中具有较高的诊断意义。