背景双光子荧光显微镜成像技术已经被视为一项重要的科学研究技术来探测细胞内的钙信号和细胞膜电位变化等。随着技术改进,近几年这种技术也可以对一些麻醉状态下的动物进行在体检测。但是,传统的双光子荧光显微镜的在体荧光成像技术局限在大脑颅顶皮层的细胞,不能直接观测到大脑深层细胞和颅底表层。下丘脑腹内侧核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH),由于位于颅底浅层,按照以往的实验方式利用双光子荧光显微镜不可能在体检测到VMH的荧光信号。目的通过颅底暴露手术联合双光子荧光成像技术实现在体记录VMH区域神经元钙离子活动信号并研究下丘脑核团活动规律。方法1.加头件将麻醉小鼠颅顶正中消毒脱毛去皮后黏上钛合金头件,并涂上厚厚的牙科水泥将周围缝隙填满,以便拍摄时牢牢固定小鼠。2.监测小鼠主要生理指标手术过程中用小鼠无创血氧仪全程监测小鼠各项生理指标。其中通过直肠探针监测体温,通过红外传感器检测心率和血氧饱和度。将小鼠放在加热垫上并将加热垫温度维持在约36°C。将小鼠仰卧位固定在加热垫上。在脖子中线做一个1厘米的切口暴露下颌腺体。然后用止血钳钝性分离肌肉直到暴露气管,将一个3厘米的橡胶管插入气管并用无菌手术线打结。4.颅底暴露手术将弯头止血钳尖端紧贴在下颌肌肉上,再将高频电刀尖端垂直放在血管钳尖端,从上至下缓慢匀速用双极电凝烧灼表面血管。用外科手术剪将两颗门牙中间剪开一个小口,再用高频电刀电切分开小鼠两颗门牙。用高频电刀从上往下电切开下颌肌肉,再用舌头环切术去掉小鼠舌头。用电刀电切小鼠上颚表面,然后用高速颅骨钻把腔隙磨大(约2.5mm x 5.0mm)再把周边的骨头磨薄至半透明状态,用镊子小心地从边缘掀开硬脑膜,去除掉腔隙全部骨头和硬脑膜。5.注射钙指示剂通过荧光标记法给小鼠下丘脑腹内侧核区域注射钙离子指示剂OGB-1,来追踪钙瞬态变化。注射完后贴上玻片并用1.5%的低熔点琼脂糖压住以减小小鼠的肌肉抖动和呼吸振动对拍摄平面的影响。6.双光子荧光显微镜下在体成像将注射过钙指示剂OGB-1的小鼠固定到双光子实验台上,用双光子显微镜下扫描VMH区域,成像深度约为-300~-550μm,拍摄速度为20.4帧/秒(像素为768x768像素)。3.气管插管结果1.成功建立一套小鼠颅底暴露下丘脑核团手术。术后成活小鼠的生理指标包括体温、血氧饱和度、心率具有普遍特征,均呈随手术时间推移缓慢波动回升。2.下丘脑腹内侧核区域自发钙活动并不一致,在被检测的时间内有的呈高频活动,有的低频活动,即使同一个神经元,其活动间隔时间也不相等,自发钙活动频率范围在0.004Hz~0.0204Hz。3.胶质细胞聚集在一起并与血管和神经元形成一个密集的网络,而与它相连的其他神经元活动时也能同时诱导胶质细胞内钙离子浓度的升高,说明了胶质细胞也具有与神经元类似的特性,可能在神经信息传递过程中起一定作用。4.通过该方法用双光子显微镜检测活体小鼠下丘脑腹内侧核细胞,2-3小时内荧光通常不会淬灭,细胞活性仍较好,能够实现较稳定的在体钙离子成像。结论我们首创了一种颅底暴露手术方法和荧光标记技术以及双光子在体成像技术相结合,实现了对活体动物下丘脑腹内侧核区域大面积神经细胞的功能变化进行三维实时监测,该手术方法同样适用于用双光子显微镜实时监测活体小鼠颅底其他重要核团。