论文部分内容阅读
白念珠菌细胞周期及抗真菌中药单体对其影响的研究 近年来,深部真菌感染的发病率逐年上升,而抗真菌药物的种类和数量相对较少以及致病真菌耐药菌株日益增多,是目前困扰医疗工作的主要难题之一。不断开发高效低毒的抗真菌药物、建立可靠的抗真菌药物敏感性检测方法,日益引起人们的关注。化学合成一种新的抗真菌化合物,周期长,耗费人力物力巨大。中医中药对真菌感染的治疗历史悠久,积累了丰富经验,利用现代工艺从中草药中分离有效的抗真菌药物有效成分,不失为开发新药的便捷途径。流式细胞仪(FCM)是综合了多项现代技术的科学仪器,在生物学、基础医学和临床医学获得了广泛应用。本课题旨在应用FCM技术,通过检测白念珠菌细胞周期,研究四种中药单体,即小檗碱、黄芩甙、丁香酚和姜黄素,对白念珠菌细胞生长的抑制作用。探索从中药中分离抗真菌药物和运用FCM技术建立抗真菌药物敏感试验方法的可能性。 首先,研究了白念珠菌在自然条件下生长的细胞周期变化规律。本研究发现白念珠菌在最初生长的28小时以内处于对数生长期,而后进入稳定生长期。白念珠菌在对数生长期细胞以S期、G2/M期或S—G2/M期为主,在稳定生长期细胞以G1期为主。本研究还首次发现,白念珠菌同其他真核生物细胞一样存在凋亡现象,而细胞凋亡的比率不随培养时间或生长速率的变化而变化,保持在一个相对稳定的值,说明白念珠菌的凋亡同样受基因控制,外界因素对其影响很小。 其次,分别研究了小檗碱、黄芩甙、丁香酚和姜黄素对白念珠菌细胞周期的影响。FCM直方图横轴反映了细胞DNA含量的荧光强度,峰值越向左表示细胞DNA的荧光强度减弱。与对照组相比,经过药物处理后的真菌细胞的荧光强度有所改变,图形峰值左移。并随着药物浓度的升高,直方图峰值越向左移动,即细胞核损伤越严重。FCM散点图纵轴FS(前向角光散射)反映了细胞体积的大小,越向下表示细胞体积越小,横轴反映了细第二军医大学博士学位论文中文摘要胞折光性和颗粒度,越向左表示细胞受损越重,与对照组相比,随着药物浓度的升高,散点图形向下和向左移动,即细胞体积越小、细胞受损越严重。在各组药物的细胞周期FCM组方图上,可以见到在Gl峰前有一个亚峰即凋亡峰,但凋亡峰值并不随药物浓度变化而变化,而与对照组的峰值接近,说明上述四种中药抑制白念珠菌生长并不是通过诱导细胞凋亡发生的,而可能是药物直接作用于细胞的超微结构。 中药宝库品种丰富,通过不断的分离研究应该可以从中得到高效低毒的抗真菌新药。FCM检测真菌细胞周期是从单细胞水平研究致病真菌在药物作用下生长受抑制的状况,反映了药物抗真菌的本质,而且“CM检测借助于激光和计算机技术,自动化程度高、结果客观、操作方便,有望成为真菌药敏试验的标准方法。当然,要把FCM技术应用于临床实验室的常规抗真菌药敏实验中还需要做许多工作。