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黄瓜(Cucumis sativusL.，2n=2x=14)是人们经常食用的瓜果蔬菜，黄瓜特有的清香味香气受到人们的青睐，这种清香味主要是来自于9个碳(C9)的醛——反，顺-2，6-壬二烯醛（(E,Z）-2，6-nonadienal)，该化合物上个世纪60年代被分离和鉴定，虽然我们知道该化合物来源于脂氧合酶(Lipoxygenase，EC1.13.11.12，LOX)——脂氢过氧化物裂解酶(Hydroperoxide lyase，HPL)通路生成，但是半个多世纪以来，我们对黄瓜果实体内如何大量积累反，顺-2，6-壬二烯醛却知之甚少。我们在黄瓜的不同组织中发现反，顺-2，6-壬二烯醛和反-2-壬烯醛这两种9个碳(C9)的醛类在黄瓜的果实特异大量积累，同为来源于LOX-HPL的6个碳(C6)的己醛(Hexanal)和反-2-己烯醛(E-2-hexenal)主要在在黄瓜叶片中大量积累，LOX-HPL途径的代谢产物在黄瓜的叶片和果实中呈现出C9醛和C6醛的组织特异性。本课题我们通过对黄瓜CsLOX和CsHPL候选基因进行系统的研究，以期能找到黄瓜果实积累C9醛的分子机理，为今后黄瓜风味育种奠定基础。 我们首先对115个重测序品种的黄瓜果实进行了搜集，共搜集了90个品种的果实，用SPME-GC-MS测定了挥发性化合物(Volatile organic compounds，VOCs)，为今后进一步在全基因组水平上深入挖掘黄瓜挥发性成分的相关基因奠定了代谢性状数据基础。我们共测定了51种挥发性化合物，通过主成分分析对90个品种的化合物进行打分，发现在黄瓜果实中，都以反，顺-2，6-壬二烯醛和反-2-己烯醛为特征效应化合物，在3个Cucumis sativus var.hardwickii野生种黄瓜中，我们发现己醛和反-2-己烯醛也是其特征效应化合物，在这3个品种中C6醛含量较高，具有和叶片类似的青草味而不像黄瓜味，在后续试验中，我们发现是由于CsLOX1表达高导致这3个野生种黄瓜C6含量高。 利用黄瓜测序品种9930公布的基因组序列信息，我们克隆了黄瓜9930的14个CsLOX和4个CsHPL全长基因，通过序列进化树分析和不同组织中的基因的表达模式，我们推测CsLOX9、CsLOX10为9-LOX功能基因，CsHPL1、CsHPL2为9-HPL功能基因，通过酵母体外酶活试验我们证实了这些基因的功能，并且发现CsLOX9-CsHPL1体外酶活能产生更高比例9个碳的醛。我们初步锁定CsLOX9和CsHPL1为黄瓜清香味形成的关键基因。 通过拟南芥体内功能验证，我们进一步证实了CsLOX9和CsHPL1这两个基因的功能。我们以AtHPL基因发生移码突变的拟南芥Col-0生态型为背景，过量表达了CsHPL1、CsHPL2、CsHPL3这3个基因，证实了CsHPL1、CsHPL2具有9-HPL活性，而CsHPL3具有13-HPL活性，在过量表达CsHPL1的株系中再转入CsLOX9能更进一步提高C9的生成。 比较有趣的是，我们发现在CsHPL1，CsHPL2过量表达拟南芥株系的叶片中虽然检测到C9的反，顺-2，6-壬二烯醛产物，但是代谢产物主要是C6的己醛和反-己烯醛产物为主;在过量表达拟南芥株系的根中发现基本不生成C6醛，而主要是9个碳的反，顺-2，6-壬二烯醛产物为主。由此我们推测黄瓜体内CsLOX9和CsHPL1能大量生成C9醛，主要原因是黄瓜果实中不含绿色组织。 为揭示绿色组织和非绿色组织中的底物差异，我们首先通过黄瓜粗蛋白体外生化试验证实黄瓜可以利用内质网上的亚油酰基磷脂酰胆碱作为底物生成反-2-壬烯醛。我们进-步对低C9醛品种CG117进行全脂类分析，对比9930品种，CG117果实含有18∶2亚油酰基或18∶3亚麻酰基支链的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺比9930果实中的含量要高，而CG117果实中这些有差异的脂肪酸含量和9930叶片比较含量相当。我们以此推测黄瓜生成C9醛的脂肪酸前体来自于内质网，CG117可能从内质网解离不饱和脂肪酸支链的某个酶发生突变，从而导致在CG117果实中的内质网上相关脂肪酸不能被CsLOX9和CsHPL1代谢积累C9醛。通过亚细胞定位我们证实CsLOX9和CsHPL1确实共定位于内质网，为消耗内质网上解离的不饱和脂肪酸提供了条件。 我们还发现CsLOX9和CsHPL1对底物有偏好性，体外用亚油酰基CoA作为底物，其主要生成为C6醛，而转基因拟南芥叶片中，我们推测其主要是由于从叶绿体上解离的亚油酰基CoA使得叶片大量积累C6醛。 通过烟草叶片Luciferase试验，我们发现在所有的CsLOX与CsHPL组合中，只有CsLOX9与CsHPL1有蛋白互作现象，我们推测在黄瓜果实中，CsLOX9和CsHPL1共定位锚定于内质网上，利用内质网上的脂肪酸为前体，最终在果实体内大量积累9个碳的反，顺-2，6-壬二烯醛和反-2-己烯醛。