前言：　　人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）先天感染可引起新生儿多种畸形和疾病。也可引起免疫低下患者（如艾滋病患者和器官移植患者）的致死性感染，危害巨大。　　目前，HCMV感染的致病机理尚不清楚。近年来，大多数学者认为病毒的自身结构，特别是与病毒的毒力、组织细胞嗜性和与病毒逃避机体免疫能力密切相关的病毒基因差异，可能是决定HCMV先天感染致病机制的内在因素。　　越来越多的研究发现在HCMV转录体系中存在HCMV预测基因的反义链转录子。　　2011年马艳萍等曾经在一个HCMV临床毒株晚期cDNA文库发现了UL83基因反义链转录本cDNA克隆。　　目前为止，尚缺乏关于HCMVUL83基因反义链转录的转录特点和转录子结构的深入研究。本课题将以HCMV低传代临床分离株为研究对象，应用cDNA文库筛选，rapid-amplificationofcDNAends(RACE)，RT-PCR和Northernblot技术，在病毒感染不同时期，对HCMVUL83基因反义链的转录和mRNA结构进行研究。本研究的完成将阐明HCMV临床株UL83基因反义链的转录特点及转录子结构，对于进一步认识HCMV预测基因反义链转录的特点，揭示其在HCMV感染致病机理中的作用具有重要意义。　　材料和方法：　　1、用于UL83基因反义链转录研究的3株临床分离株H，C，X均来自2006至2007年中国医科大学附属盛京医院住院患儿，年龄小于5个月。临床症状包括:巨细胞病毒性肝炎，先天性胆道闭锁，先天性心脏病，百日咳综合症，癫痫，急性支气管肺炎等。　　2、HCMV分离株分离培养　　(1)人胚肺细胞传代培养　　(2)HCMV传代培养　　①HCMV原代接种　　②HCMV传代培养　　(3)毒株收集　　①即刻早期(IE)　　②早期(E)　　③晚期(L)　　3、样品总RNA抽提　　根据Invitrogen公司的Trizolreagent操作。　　分光光度计测量OD260和OD280值。总RNA电泳，电泳条件:1.5％琼脂糖凝胶，EB染色;100V电泳20min。　　4、提取临床分离株DNA　　取HCMV低传代分离株H接种细胞的培养上清液与等量裂解液（华美生物工程公司）混合，煮沸15min，备用。　　5、将cDNA文库进行分级处理　　将本实验室之前已经构建好的HCMVH株晚期表达的cDNA文库的重组体转化到大肠杆菌DH5α细胞中，随机挑选8600个单克隆并人为的将这些单克隆进行分级并分组。　　6、设计基因特异性引物，应用cDNA文库筛选技术筛选出cDNA文库中含有UL83基因反义链的预测转录本的阳性克隆。　　7、应用Northernblot实验检测UL83基因反义链的转录时序和转录本的数量和长度。　　8、应用5RACE及3RACE获得基因转录本确切的5端及3端序列。　　结果：　　UL83基因反义链转录特点和转录子结构　　1、从cDNA文库中筛选出三个含有UL83基因反义链特异序列的阳性cDNA克隆。三个克隆均在相同位置发现有加尾信号及PolyA尾。　　2、在Northernblot实验中，用与HCMVUL83基因反义链互补的单链RNA探针杂交，结果表明UL83基因反义链互补的探针仅在临床分离株HAN株晚期中检测到4簇转录本。其长度分别为:800nt，1，200nt，1，500nt，和1，800-2，600nt，通过不同的探针我们发现这4簇转录本具有相同的3末端，不同的5起始端。　　3、UL83基因反义链转录子3RACE实验与文库筛选的实验获得的3端位置高度吻合。针对Northernblot实验中获得4种转录本应用5RACE的方法对其5端分别进行检测，最终得到了UL83基因反义链5端的相对位置，分别位于nt120382，，nt120187～120196，，nt19840，nt119255～119455。参考序列HCMVAD169(X17403.1)。　　结论：　　UL83基因反义链转录特点和转录子结构　　1、HCMVUL83基因反义链主要在L期转录，推测其是L期基因。　　2、HCMVUL83基因反义链具有四种转录本结构。他们具有相同的3末端其位置位于参考HCMVAD169(X17403.1)的nt121153;5末端位置不同。