猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是由冠状病毒科冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)引起的一种以呕吐、脱水、严重腹泻为主要特征的急性、高度接触性传染病。产肠毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的一种重要的肠道病原菌,能够引起仔猪黄痢和仔猪白痢等。根据GenBank中公布的TGEV的S蛋白A、D基因序列和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因序列,分别设计1对引物,采用RT-PCR技术扩增含A、D位点的S1基因和LTB基因,各自将其插入pET-28a(+)载体中构建原核表达质粒,并进行PCR、酶切鉴定及序列测定。重组菌经诱导表达后,表达产物用SDS-PAGE和Western-blot进行检测。　　 RT-PCR扩增得到了S1基因片段,该基因全长980bp,编码262个氨基酸,序列分析显示S1基因与GenBank中公布的S1基因序列同源性达97％以上,氨基酸序列同源性达95％以上,表明不同毒株S1基因高度保守性。表达获得的S1蛋白约33.7ku,并且表达产物主要以包涵体的形式存在；Western-blot分析表明,表达的S1蛋白可以被TGEV阳性血清所识别,具有反应原性。同样,PCR扩增得到的LTB基因全长375bp,编码124个氨基酸,序列分析显示LTB基因与GenBank中公布的LTB基因序列同源性达99％以上,氨基酸序列同源性达98％以上。表达获得的LTB蛋白约14ku。Western-blot分析表明,LTB蛋白能被ETEC阳性血清所识别,具有反应原性。　　 重新设计1个引物,使LTB基因的终止密码子TAG突变为TAC,且在其下游添加EcoRI酶切位点。另设计1个引物,在S1基因上游引入EcoRI酶切位点,并以上述试验扩增的S1基因和LTB基因为模板,再次进行PCR扩增,扩增产物经酶切和连接等技术重组成LTB2-S1-2基因,该基因全长1371bp,编码461个氨基酸。将LTB2-S1-2插入pET-28a(+)中构建重组原核表达质粒。诱导表达获得约45ku的融合蛋白,并且主要以包涵体的形式存在。Western-blot分析表明,表达的目的蛋白能被TGEV阳性血清或ETEC阳性血清所识别,表达的蛋白为特异的蛋白。本试验为开发和生产同时抗TGEV与ETEC的基因工程亚单位疫苗提供了物质基础。