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目的研究结核分枝杆菌参与的巨噬细胞自噬发生过程当中MicroRNAs(miRNAs)的调节途径,并探讨其相应的作用机制。方法1.建立雷帕霉素刺激RAW264.7巨噬细胞模型,分别处理2小时、4小时、6小时、8小时后,Real-Time PCR检测miR-30b、miR-106、miR-214、miR-183miR-376c、miR-200a、miR-17-5p、miR-142-3p、miR-30c、miR-377相应的表达量。2.选用miRanda等生物信息学软件对miR-17-5p靶基因行相关的预测实验。通过预测确定将ULK1作为研究的靶基因,之后构建其3’UTR的报告载体,即为重组双荧光素酶报告载体,内参为海肾荧光素酶,通过计算相对荧光素酶活性(萤火虫与海肾的荧光素酶活性比值),检测miR-17-5p对荧光素酶活力的影响,验证miR-17-5p与ULK1之间的关系。同时使用实时荧光定量PCR和Western blot检测ULK1的表达。3.将miR-17-5p模拟物或者抑制剂转染于RAW264.7细胞当中,培养24小时之后使用雷帕霉素和BCG分别开来刺激RAW264.7细胞,作用2小时,收集细胞,提取相应的总的RNA和相应的总的蛋白,以此来检测靶基因ULK1在mRNA表达水平,同时检测LC3B的蛋白表达水平。4.将miR-17-5p模拟物或抑制剂分别转染至RAW264.7细胞,培养24小时后,利用雷帕霉素和BCG分别刺激RAW264.7细胞2小时,固定细胞,包埋切片后利用透射电镜的方式来对自噬情况进行观察。固定各组相应的细胞,经过免疫荧光的试验之后,则利用共聚焦显微镜观察FITC-LC3蛋白表达情况。结果1.雷帕霉素处理RAW264.7巨噬细胞后,分别于2小时、4小时、6小时和8小时利用实时荧光定量PCR检测miRNA的表达水平,检测结果显示:在2、6、8小时表达上调(2.3倍以上,P<0.05)的有miR-17-5p、miR-214、miR-142-3p、miR-106a、miR-376c和miR-30c,而miR30b、miR214、miR142-3p、miR376c和miR200a则在4小时表达下调(P<0.05)。miR-183下调表达在2,6,8小时(P<0.05)。综上所述,miR-200a、miR-30b、miR-377、miR-30c、miR-376c、miR-17-5p等表达量有显著变化,在四个时间段内miR-17-5p稳定高表达,提示miRNA可能影响细胞自噬的过程,其很可能是通过对有关自噬基因进行调控,得以实现对自噬的影响。2.通过双荧光素酶实验证实了miR-17-5p可以靶向结合ULK1 3’UTR的保守位点并且抑制其表达;实时荧光定量PCR结果显示:在mRNA水平ULK1的的表达跟转染miR-17-5p模拟物或miR-17-5p抑制剂与否无影响;Western blot分析表明:miR-17-5p的表达抑制ULK1蛋白水平(P<0.05),抑制miR-17-5p之后,ULK1的蛋白质表达则明显升高(p<0.05)。这些结果表明,miR-17-5p对于ULK1表达的影响是在转录后水平调控的,是抑制其翻译过程从而影响ULK1蛋白质的表达。3.通过检测自噬蛋白LC3B的表达,观察miR-17-5p对整个自噬过程的调控作用,而通过检测ULK1的表达则是探究其是否为miR-17-5p的靶标。结果显示:LC3B蛋白在巨噬细胞中的表达降低(P<0.05),转染miR-17-5p模拟物后;而转染miR-17-5p inhibitors后RAW264.7巨噬细胞中LC3B蛋白表达显著性升高(p<0.05)。透射电镜和激光共聚焦显微镜的结果显示,miR-17-5p mimic显著抑制雷帕霉素和BCG诱导的细胞自噬。这些结果表明miR-17-5p可以通过靶向作用ULK1的表达,影响LC3B蛋白表达,在细胞自噬通路中起到负向调控作用。结论1.RAW264.7巨噬细胞经卡介苗的感染后,miR-17-5p稳定性高表达,表明其可能调节卡介苗诱导的巨噬细胞自噬。2.miR-17-5p可以靶标ULK1表达调控自噬标志物LC3B,抑制自噬的发生,负向调控BCG诱导的RAW264.7巨噬细胞自噬途径。