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人 FAM76B 基因(Family with sequence similarity 76B,FAM76B)定位于人11q21染色体上,基因全长为21,468bp,cDNA全长为1,020 bp,有10个外显子,编码的蛋白含有339个氨基酸,分子量约为38.7 κD。成熟的FAM76B蛋白定位于细胞核内,并呈散在斑点状分布。FAM76B蛋白非常保守,人FAM76B氨基酸序列与小鼠FAM76B氨基酸序列具有非常高的同源性(98%)。目前,对FAM76B基因的功能研究较少。本实验室前期研究结果表明,FAM76B基因在小鼠的各个组织中均有广泛的分布,表达量最高的三个组织分别是:脑、肝脏、脾脏,FAM76B基因敲除会导致小鼠肝脏脂代谢异常,但其发生机制尚不明确。为了研究FAM76B基因功能及其转录调控,本课题利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在FAM76B基因下游定点插入荧光素酶(Luciferase)报告基因,构建FAM76B-Luciferase-KI HEK293细胞系,使Luciferase的表达水平能够灵敏、准确地反映出细胞内FAM76B基因的表达水平,同时利用荧光素酶报告系统能够对FAM76B基因的表达进行定量检测。这种新的细胞系能够用于FAM76B基因的表达调控的研究,筛选影响FAM76B基因表达的转录因子及与脂代谢相关的小分子药物,进而可以深入探索FAM76B基因的功能。本课题具体研究内容包括以下几个方面:1.靶向FAM76B基因的sgRNA设计、活性检测以及打靶载体的构建:选择基因组中FAM76B基因的终止密码子下游区域作为sgRNA的打靶区域,通过序列比对分析,在该区域筛选出3个潜在的特异性高的sgRNA的结合位点,并分别构建相应的sgRNA的表达载体。利用T7 E1 assay进行检测,筛选获得的sgRNA具有较高的切割活性,将筛选得到的具有高生物活性的sgRNA与Cas9共表达,得到靶向FAM76B基因的打靶载体。由此获得的打靶载体可用于后续细胞系的建立。2.靶向FAM76B基因的供体载体的构建:通过分子生物学手段,成功构建了包含FAM76B基因打靶区域上、下游同源臂、Luciferase报告基因、eGFP、Neomycin、mCherry以及自杀基因(TK)的供体载体。其中,Luciferase报告基因、eGFP、Neomycin位于上、下游同源臂之间,eGFP与Neomycin作为正筛选基因;mCherry和TK基因位于下游同源臂外侧,作为负筛选基因。供体载体同时携带有正、负筛选基因,通过eGFP及mCherry的表达情况能够对同源重组的细胞和随机插入的细胞进行区分;TK基因能够剔除随机插入的细胞,同时,Neomycin能够富集进行了同源重组的细胞,由此可以有效增加同源重组的细胞所占的比例。3.FAM76B-Luciferase-KI HEK293细胞系的建立及鉴定:首先,将构建好的打靶载体与供体载体共同转染至HEK293细胞,使用G418进行正筛选,GCV进行负筛选。然后,利用有限稀释法对药物筛选后的细胞做克隆化,克隆化后的细胞提取基因组,利用PCR法进行重组细胞的初步鉴定,挑选鉴定正确的克隆进行测序验证。最终获得了在FAM76B基因下游定点插入Luciferase报告基因的单一、稳定细胞系,命名为FAM76B-Luciferase-KI HEK293细胞系。4.影响FAM76B基因表达的转录因子的筛选:选取可能影响FAM76B基因表达的转录因子利用上述所构建细胞系进行进一步的筛选。首先,将待筛选的转录因子表达载体分别转染本课题构建的FAM76B-Luciferase-KI HEK293细胞系,同时转染空载体作为对照组。研究结果表明,C-MYB和STAT5A对FAM76B表达具有抑制作用,C-Ets-1对FAM76B表达具有促进作用。随后,将这三种转录因子分别转染野生型的HEK293细胞,利用Real-time PCR和Western blot分别检测FAM76B基因的mRNA和蛋白水平的表达,结果均表明C-MYB和STAT5A对FAM76B表达具有抑制作用,C-Ets-1对FAM76B表达具有促进作用。上述研究结果进一步表明,所建立的细胞系中Luciferase的表达水平能够灵敏、准确地反映出FAM76B基因的表达水平。5.影响FAM76B基因表达的小分子化学药物的筛选:前期研究结果表明,FAM76B基因敲除会导致小鼠肝脏脂代谢异常,因此,本课题将利用建立的细胞系从脂代谢相关小分子化学药物库中筛选能够影响FAM76B基因表达的小分子化学药物。研究结果表明,有三种小分子化学药物可以显著性调节Luciferase 的表达,它们分别是 Pioglitazone、Dihydroartemisinin 和 Tanshinone I,其中 Pioglitazone 能够促进 FAM76B 的表达,Dihydroartemisinin 和Tanshinone I能够抑制FAM76B的表达。然后,将筛选得到的三种小分子化学药物分别对野生型的HEK293细胞进行处理,同样利用Real-time PCR和Western blot分别检测FAM76B基因的mRNA和蛋白水平的表达,对筛选的药物进行进一步的确认。结果表明,Pioglitazone能够促进FAM76B的表达,Dihydroartemisinin和Tanshinone I能够抑制FAM76B的表达。上述研究结果表明,所建立的FAM76B-Luciferase-KI HEK293细胞系可以作为筛选影响FAM76B基因表达的小分子药物的有用工具。综上所述,本课题获得了如下的实验结果:1)利用CRISPR/Cas9技术在FAM76B基因下游定点插入了 Luciferase报告基因,成功建立了 FAM76B-Luciferase-KIHEK293细胞系;2)利用该细胞系成功筛选出影响FAM76B基因表达的转录因子,为FAM76B基因功能研究奠定了坚实的基础;3)利用该细胞系成功筛选出影响FAM76B基因表达的小分子化学药物,为FAM76B基因的功能研究提供新的思路与方法。以上实验结果表明,FAM76B-Luciferase-KI HEK293细胞系内的Luciferase的表达水平可以灵敏、准确地反映出FAM76B基因的表达水平,这种新的细胞系不但可以用于FAM76B基因功能的研究,也可以作为筛选影响FAM76B基因表达的转录因子以及小分子药物的有用工具。同时,本课题利用CRISPR/Cas9技术在靶基因的下游定点插入报告基因,以报告基因的表达水平来反映靶基因的表达水平,这种方法也可以用来对其他基因进行相关研究。