【摘 要】
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禽白血病（avian leukosis）被认为是造成养禽业严重经济损失的重要原因之一,但目前对该病缺乏有效的防治手段。鸡TVB（tumor virus locus B）是控制B亚型禽白血病病毒（avian leukosis virus）入侵宿主的受体基因,本研究使用成簇的规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic re
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禽白血病（avian leukosis）被认为是造成养禽业严重经济损失的重要原因之一,但目前对该病缺乏有效的防治手段。鸡TVB（tumor virus locus B）是控制B亚型禽白血病病毒（avian leukosis virus）入侵宿主的受体基因,本研究使用成簇的规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）多重基因编辑技术,针对鸡TVB位点进行基因敲除研究,比较了该技术与常规CRISPR基因编辑技术的效率,并进一步探究了制备TVB基因敲除鸡的可行性。此外,本研究初步建立了基于CRISPR相关蛋白9（Cas9）与增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）过表达单克隆细胞株和多重向导RNA体外转录的新型CRISPR多重基因编辑体系,提高了多重基因编辑的便捷性。研究取得如下结果:1.CRISPR多重基因编辑技术敲除鸡TVB基因针对TVB基因第二和第三外显子共设计了8条Cas9基因编辑系统的向导RNA靶序列,在HEK293T细胞中利用SSA报告系统证明上述8条向导RNA均具有切割活性。分别构建表达单个向导RNA的质粒和同时表达4个向导RNA的多重基因编辑质粒,转染鸡DF-1细胞系后嘌呤霉素药筛,经T7E1酶切检测发现4个向导RNA介导的多重基因编辑显著提高了TVB基因的敲除效率;基因测序结果证实TVB基因被成功敲除且多重基因编辑策略可产生大片段删除。按上述流程进行CRISPR相关蛋白12（Cas12a）系统的多重基因编辑研究,发现其效率显著高于常规基因编辑,但低于Cas9多重基因编辑。通过显微注射法将CRISPR/Cas9多重基因编辑腺病毒载体注射入鸡胚,发现其可以在活体鸡胚内实现高效基因敲除,证明CRISPR多重基因编辑具有制备基因编辑鸡的潜力。2.新型CRISPR/Cas9多重基因编辑体系的建立为克服上述基于质粒或病毒同时表达多个向导RNA的CRISPR多重基因编辑过程繁琐的缺陷,本研究利用表达Cas9蛋白和报告基因EGFP的Piggy Bac转座子质粒结合嘌呤霉素药物筛选,制备了Cas9/EGFP过表达的HEK293T单克隆细胞株,并测定其外源插入基因的拷贝数为6,细胞增殖活力与对照细胞无显著差异。针对该细胞株的内源基因FANCF和多拷贝外源基因EGFP各设计了3条和4条靶序列,通过体外转录的方式制备了向导RNA,体外切割结果显示上述向导RNA均具有靶向活性。将体外转录的向导RNA通过脂质体转染进入上述Cas9/EGFP过表达的单克隆细胞株,经T7E1酶切和荧光强度检测后发现,此方法对单拷贝基因FANCF和多拷贝基因EGFP均可实现高效的多重基因编辑。上述研究证实了CRISPR多重基因编辑在敲除鸡TVB基因中的高效性,为后续制备TVB基因敲除的禽白血病抗性鸡奠定了基础,本研究建立的基于Cas9/EGFP过表达单克隆细胞株和向导RNA体外转录的新型CRISPR多重基因编辑体系,为在特定细胞中大规模开展基因编辑研究提供了指导
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