放线菌天然产物在人类的疾病史上发挥着非常重要的作用,为人类贡献了许多抗生素。遗传操作在放线菌天然产物药物研究中扮演了极其重要的角色,而传统的同源重组方式往往由于周期长、依赖于筛选标记、筛选量大等劣势,极大地增加了工作量,同时也限制了其应用范围。因此,我们迫切需要完善放线菌的遗传操作体系,以更有效率地对放线菌次级代谢潜能进行挖掘研究。本实验室一直以来致力于放线菌天然产物挖掘,并且构建"万株基因组"库用于研究。本研究这对两种特殊的稀有放线菌海洋疣孢菌MS100137和嗜甲基拟无支酸菌,构建了基于CRISPR/Cas9的遗传操作体系,并将其初步应用于次级代谢产物的相关研究。主要取得了以下几点结果:1.利用遗传学手段初步解析proximicin生物合成机制(1)在海洋疣孢菌中建立了高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功删除掉了长达90kb的片段,效率高于75%;(2)应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对MS100137中NRPS基因簇进行删除工作,发现C17和C12与proximicins的生物合成相关,这两个基因簇均含有大量的未知功能基因,预示着其中有新的机制;(3)通过对MS100137菌株的发酵,发现在产物中仍然存在着很多的新颖proximicin类化合物,其中检测到一个相对分子量为307的proximicin,推测其结构是在proximicin A基础上增加了一个甲基,显示了 proximicin的结构的多样性和活性潜能;(4)基于proximicin结构以及基因簇中基因的注释,对proximicin的生物合成通路进行了推测。2.嗜甲基拟无支酸菌中amychelin新类似物活的分离以及菌株底盘构建(1)在嗜甲基拟无支酸菌中建立了 CRISPR/Cas9基因编辑技术,在删除掉一个约60kb的amychelin合成基因簇片段的同时,导入了 phiC31整合位点,效率高达100%,显示出CRISPR/Cas9技术强大的基因编辑能力,同时也为之后研究此类菌株打下了基础。(2)通过补料发酵amS基因敲除菌株产生的新化合物进行分离工作,分离到5个新的amychelin类化合物,获得的化合物中,4F-2在铜绿假单胞菌感染线虫模型上有着良好的拯救线虫,EC50为1.352 μM。同时,通过多种水杨酸类似物的补料发酵,我们发现部分类似物如5F-水杨酸、5Br-水杨酸、4-甲基水杨酸等的补料发酵结果中也产生相应的新颖amychelin类似物。本研究针对两株稀有放线菌MS100137和嗜甲基拟无支酸菌239T成功构建了基于CRISPR/Cas9的基因组编辑系统。本研究通过CRISPR/Cas9确定了proximicin生物合成基因簇,并推定了其合成通路,为后续的深入研究打下了基础。另一方面,本研究删除了 A.methano/ica 239T中amychelin基因簇并引入一个phiC31整合位点,此外,针对基于遗传学手段构建的amychelin合成通路改造突变株,本研究分离获得了具有良好活性的新化合物,为后续的抗菌药物深入研究打下的坚实的基础。