养蚕业是中国农业的重要组成部分,尤其是在西部地区,对增加农民收入起着重要作用,近几年桑蚕业的综合利用也得到了较大发展。作为蚕丝业的主角-家蚕,其生长发育过程所体现的化性,眠性以及其他的生活习性和优质蚕茧的生产,优质蚕种的制造以及蚕种的保护都息息相关。如何对我们种质资源进行合理的开发、利用与保存至关重要,本实验室在探寻无滞育多化性品种冬季保存方法的过程中发现,大多数无滞育多化性品种可通过体外注射滞育激素使其产下滞育卵从而解决冬季保存难的难题。但其中一个无滞育多化性品种MF注射滞育激素后依然不能产下滞育卵,是一个非常有趣和特殊的现象。本研究以此特殊现象为出发点,基于家蚕滞育激素调控的滞育信号通路,对该特殊素材的滞育激素基因和滞育激素受体基因进行克隆和结构分析,并对不同化性品种家蚕在蛹期和幼虫期的滞育激素基因和滞育激素受体基因进行表达模式分析,同时对相关候选基因进行RNA干涉来探究其功能,这为完善家蚕滞育基因调控网格,解析家蚕滞育机理提供一定的理论基础,同时也为农业生产中害虫防治起到积极的借鉴作用。主要研究结果如下:1、家蚕MF品种DH基因的克隆及不同化性品种DH基因的表达模式分析为探究给家蚕多化性品种MF的蛹体注射滞育激素仍无法诱导其产下滞育卵的原因,从该品种5龄第3天幼虫头部组织克隆了滞育激素基因(DH)的全长cDNA,其中包含44 bp的5′端非编码区和173 bp的3′端非编码区,以及一个大小564 bp的ORF,编码187个氨基酸残基,克隆的该基因片段命名为Bm DH-MF。BLAST比对显示,克隆的滞育激素基因编码氨基酸与NCBI数据库中来自家蚕二化性品种大造的滞育激素基因(BAA059713)编码氨基酸的序列相似度为90.1%。运用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术检测滞育激素基因在3个不同化性家蚕品种蛹期头部和卵巢以及家蚕品种MF5龄期雌、雄幼虫不同组织中的转录表达水平,结果显示:该基因mRNA在家蚕品种MF雌、雄幼虫的头部、血液、生殖腺3个组织中有转录,中肠、丝腺、马氏管、表皮、脂肪体5个组织中没有检测到转录;该基因在不同化性家蚕品种蛹期头部和卵巢的转录水平存在差异,转录量从高到低依次为二化性家蚕品种C108,多化性品种MF、尼斯塔里。2、家蚕MF品种DHR基因克隆及不同化性品种DHR基因的表达模式分析从滞育激素信号接受器—滞育激素受体(DHR)入手,从该家蚕MF品种中克隆了DHR基因的全长cDNA,序列分析表明:该基因序列全长2204 bp,包括371 bp的5’端非翻译序列(5’-UTR)和370bp的3’端非翻译序列(3’-UTR),其开放阅读框(ORF)为1309bp,编码436个氨基酸。结构分析表明该基因编码的蛋白质与其他家蚕品种存在差异。运用半定量RT-PCR及qRT-PCR技术检测滞育激素受体基因在不同家蚕品种蛹期的血液和卵巢以及同一家蚕品种MF 5龄幼虫的不同组织(血液,头部,脂肪体,丝腺,中肠及卵巢)中的表达水平。结果表明:DHR在家蚕MF品种幼虫的五个组织中都有表达,在血液和卵巢组织中表达较高;另外该基因的表达水平在不同化性家蚕品种存在差异,即使在同为无滞育多化性的2个品种间也存在显著差异,在MF品种中的表达水平明显低于尼斯塔里。3、RNAi干涉DHR基因对家蚕化性变化的研究根据滞育激素受体基因的cDNA全长序列,人工设计并体外合成了位于DHR基因ORF中部的dsRNA片段(长度为276bp),稀释成不同浓度梯度dsRNA对不同化性家蚕品种雌蛹进行了显微注射,观察雌蛹化蛾交配后的产卵情况及后代的孵化情况,并利用实时荧光定量PCR检测了注射组和对照组蛹期DHR的相对变化量,结果表明:二化性家蚕品种的滞育激素受体经较高浓度滞育激素受体基因的dsRNA干涉后表达量较对照组出现下降趋势,并且经干涉后的二化性品种C108产下了非滞育卵。由此可看出家蚕的胚胎不滞育性与DHR过低表达直接相关,推测MF不能被DH有效作用的原因与DHR过低表达有关。