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【研究背景及目的】 贲门失弛缓症是一种食管运动障碍性疾病，以食管体部正常蠕动消失及吞咽时下食管括约肌（lower esophageal sphincter，LES）松弛不良为特征。LES松弛是由抑制性神经元释放血管活性肠肽和一氧化氮共同作用的结果，而LES收缩和张力升高由外源性胆碱能神经释放乙酰胆碱调控；正常情况下，两者处于相对平衡状态，使LES静息压（LESP）维持在10-20mmHg。由于乙酰胆碱的水解主要由乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）参与完成，如果LES内的乙酰胆碱酯酶减少，乙酰胆碱的水解也随之减少，导致LES压力升高；增加LES内的乙酰胆碱酯酶，可加速乙酰胆碱的水解，使LES压力降低。 复制缺陷型腺病毒是基因治疗疾病广泛使用的基因转移系统，该载体系统具有宿主范围广、可感染分裂期及静止期细胞、包装容量大、不发生整合、繁殖滴度高等优点，在基因治疗研究中得到广泛应用。传统构建重组腺病毒的方法繁琐低效，近年来，He等建立了在大肠杆菌内重组腺病毒的AdEasyTM系统，借助细菌内高度有效的同源重组机制并利用抗生素筛选，在短时间内便可得到所需要的重组腺病毒；此外由于在重组同时整合了绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因，可以直接观察转染和感染效率，大大方便了腺病毒的重组与鉴定。 本研究应用阳离子去垢剂氯苄烷铵（Benzyldimethyltetradecylammonium chloride，BAC），制备猫LES去神经模型，探讨贲门失弛缓症的发病机制和乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）在贲门失弛缓症中的作用，并应用乙酰胆碱酯酶作为外源目的基因，利用AdEasyTM系统构建表达AChE的重组复制缺陷型腺病毒AdAChET，通过体外实验证实其在平滑肌的表达，进一步利用AdAChET导入猫贲门失弛缓症动物模型体内研究其松弛LES的作用，为治疗贲门失弛缓症提供有效的基因治疗途径。 【实验方法】 一、AChE在贲门失弛缓症模型发生中的作用 将24只健康猫，随机分为模型组和对照组（每组12只）。氯胺酮20mg／kg肌肉注射麻醉后，模型组于内镜下对LES处分4点环形注射4mmol／L BAC，2ml／第二军医大学博L论文中文摘要只;对照组在相同条件下注射生理盐水Zml/只，饲养8周。分别在注射BAC或生理盐水前和8周后，行食管钡剂造影，并检测食管动力学变化。并在8周后处死猫，取LES行HE染色和免疫组织化学分别测定下食管括约肌AChE、Ch-AT的表达，应用DTNB法检测AChE活力变化，应用电子显微镜观察肌间神经丛及其神经末梢和平滑肌的变化。二、乙酞胆碱酷酶基因重组腺病毒的构建及其对食管平滑肌细胞的影响 1.乙酞胆碱酷酶基因重组腺病毒的构建:将AChET表达质粒pEFbos/A ChET扩增、酶切，获取AChET cDNA片段。体外连接构建重组穿梭质粒pAdTrack一CMV-AChET，Pacl酶切线性化后与骨架载体AdEasy一1在大肠杆菌BJS 183内同源重组获得腺病毒质粒pAdAChET，经293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒AdAChET，同法构建空载病毒AdGFP（无外源基因，仅表达GFP）作为对照病毒。 2.检测AdAChET在猫平滑肌细胞中的表达:分离制备原代培养的猫平滑肌细胞，AdAChET以一定滴度体外感染平滑肌细胞，利用westem blot、RT一PCR法检测AChE在平滑肌细胞的表达，DINB法测定AChE活力。三、乙酞胆碱醋酶基因体内导入对责门失弛缓症模型的影响 36只家猫，随机分为4组，每组9只，普通饲料喂养，自由饮水。第1组，为正常对照组;第2碑组为责门失弛缓症模型组，动物经氯胺酮20m眺g肌肉注射麻醉后，在胃镜下于LES处分4点环形注射4mmol几BAC，Zml/只，正常对照组在相同条件下注射生理盐水Zml/只。其中第2组为模型对照组，于注射BACS周后经胃镜在LES内环形注射生理盐水Zml/只，第3组为空白病毒AdGFP组，于注射BAcs周后经胃镜环形注射4x1OgpfuAdGFP;第4组为AdAchET组，于注射BAcs周后经胃镜注射4xl护pfu AdAchET。分别于注射BAc或生理盐水前（造模前）和8周后（治疗前）、治疗后10天行食管钡剂造影观察其影像学变化，检测食管动力变化。猫处死后，取出LES，利用RT一PCR和免疫组化法检测AChE的体内表达，DINB法测定AChE活力。【实验结果】一、制备猫责门失弛缓症模型 1.注射药物后8周模型组食管下段钡剂储留，呈典型的“鸟嘴征”，对照组钡剂通第二军医大学博士论文中文摘要过顺利;模型组LESP为32.5毋4.06 mmHg，较注射前16.50士3.83 mmHg有显著性差异（p<0.01），而对照组注射前后LESP差异不显著（17.40玛.02vs18.8肚2.33Hg）（p>0.05），两组平均收缩波幅在注射前后（模型组67.40士9.91vs 66.26士14.68 nunHg;对照组63.20士13.52 vs 59.15士10，13 nunHg）无显著性差异 （p>0.05）;注射BAC前后模型组LES松弛率（95.3士4.3%vs 35.6士5.2%）和松弛度（93.6士3.9%vs 32.5士3.3%）有显著差异（p<0.01）。 2.HE染色显示模型组环肌层和纵肌层之间可见大量的淋巴细胞、浆细胞和少量的中性粒细胞浸润，对照组正常;免疫组化显示模型组环肌层、纵肌层以及二者之间的AChE阳性产物较对照组明显减少，AChE阳性神经元减少;两组ChAT阳性神经无差异(p>0.05