谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是生物体内广泛存在的一类可溶性蛋白,它们由一个庞大的基因家族编码。根据它们的基因序列特征可以把GSTs分为七大类：Phi、Tau、Theta、Zeta、Lambda、DHAR(脱氢抗坏血酸还原酶)和TCHQD(四氯对苯二酚脱卤素酶)。其中Tau类GSTs (GSTU)为植物所特有,并且在抵抗胁迫和次级代谢等生理过程中发挥着重要作用。前人研究发现GSTs可受到多种因素诱导,水杨酸(Salicylic Acid, SA)可以诱导其早期启动与表达。本研究拟根据其早期启动表达受SA诱导的特性,分离SA诱导型启动子,为农业生产和生物学研究提供一个可控的表达调控元件。本研究以脐橙为材料,采用SA对其叶片进行处理,分离克隆上调表达GSTU19基因,继而用染色体步移的方法分离出其启动子,通过启动子元件分析软件扫描,发现该启动子序列中存在多种与诱导表达相关的调控元件。为了进一步证实该启动子功能,构建了3个该启动子序列缺失的表达载体,并通过多种遗传转化方法对其进行验证。主要结果如下：1.甜橙CiGSTU19受SA诱导表达。荧光定量PCR实验结果显示：5mmol/L SA处理红肉脐橙叶片后,叶片中CiGSTU19 RNA的表达量水平在8小时内快速上升,随后又回复到正常状态。结果表明GSTU19能快速响应SA的刺激,在完成SA的信息传输后又恢复到正常的表达水平。因此,初步推测CiGSTU19启动子可以受SA诱导而启动表达。2.OGSTU19启动子的克隆和分析发现OGSTU19启动子中有多种与SA诱导相关的元件。使用染色体步移的方法克隆了CiGSTU19的启动子,通过生物信息学分析发现CiGSTU19的启动子中存在着多种与SA诱导相关的元件,如被WRKY转录因子所结合的W-box、能被bZIP类蛋白所识别的ACGT元件以及ARR1结合元件等。3.CiGSTU19启动子序列缺失载体构建。为了进一步验证该启动子受水杨酸诱导,本研究设计了一系列该启动子序列缺失的表达载体,2个较短插入片段(400bp、700bp)的pCAMBIA1391系列载体成功转化到拟南芥中。GUS组织染色结果表明,300bp的启动子序列已经具备启动转录功能；另序列分析的结果显示-300bp～+118bp的启动子序列中含有3个CaMV 35S启动子中的GATA元件；这结果说明,CiGSTU19启动子的300bp片段已经是一个强启动子。原生质体瞬时表达和水杨酸诱导处理实验结果显示,不论是GFP还是GUS的表达都受水杨酸诱导影响,说明-700bp启动子插入片段可能含有水杨酸诱导相关元件。4.瞬时转化方法的摸索。本研究试验了多种瞬时表达方法：农杆菌介导的注射叶片法、农杆菌介导的真空渗透法、原生质体瞬时表达等。前两者的GUS组织染色实验没有着色,结果都不理想。分析原因可能是这两种方法的转化率都不高,菌液只是进入了植物组织间隙,而没有进入细胞内,无法为基因提供一个合适的环境进行基因的表达。原生质体的转化效率比较高,而且整个实验过程较短,只需要2-3天的时间,是一个较理想的瞬时转化方法。