甘氨酸调控猪卵母细胞钙稳态失衡诱导的内质网应激的机制研究

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高质量的成熟卵母细胞对受精后植入前胚胎发育潜能至关重要。但是,在卵母细胞的体外培养过程中,微环境的改变会造成细胞内稳态失衡,引起应激反应,如钙稳态失衡引起的内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS),并造成卵母细胞成熟质量下降。本研究旨在探究猪卵母细胞体外成熟过程中甘氨酸对钙稳态失衡诱导的ERS的调控作用、效果及机制,从而提高卵母细胞体外成熟效率和质量。(1)研究了甘氨酸对猪卵母细胞内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)功能的调控作用。结果表明,添加甘氨酸后,卵丘细胞扩散平均直径及卵母细胞第一极体排出率都显著高于对照组。进一步试验表明,甘氨酸组ER水平显著高于对照组;通过实时荧光定量(q PCR)对ERS相关基因检测,结果显示添加甘氨酸可显著下调CHOP、Xbp1、ATF4基因。钙离子荧光染色结果显示:甘氨酸组的胞质钙离子([Ca2+]i)和线粒体钙离子([Ca2+]m)水平显著低于对照组,但ER钙离子([Ca2+]ER)水平显著高于对照组。本研究证实甘氨酸对猪卵母细胞ER功能和钙稳态具有调控作用。(2)探究了甘氨酸对猪卵母细胞钙稳态失衡诱导的ERS的调控效果。以Ca2+-ATPase抑制剂毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)建立猪卵母细胞ERS模型,添加甘氨酸后检测调控效果。结果显示:甘氨酸能够显著提高TG诱导的卵母细胞成熟率和ER水平,下调TG处理的猪卵母细胞中ERS相关基因的表达(CHOP、Xbp1、ATF4、ATF6、Grp78)。对Ca2+水平检测发现,与TG组相比甘氨酸组可以显著降低[Ca2+]i和[Ca2+]m水平,升高[Ca2+]ER水平,并且下调钙网蛋白CALR的基因表达。此外,细胞免疫荧光结果证明,添加甘氨酸可恢复钙通道蛋白三磷酸肌醇受体1(IP3R1)、线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)蛋白在细胞内的分布位置,促进其形成皮质簇,同步下调IP3R1、葡萄糖调节蛋白75(Grp75)、VDAC1基因的表达。进一步研究发现,添加甘氨酸可改善TG诱导的线粒体膜电位下降,并显著降低活性氧水平,还能显著下调促细胞凋亡相关基因Bax、Cyto C、Caspase 3的表达,减少细胞凋亡。孤雌激活(Parthenogenetic Activation,PA)结果表明,甘氨酸可以提高TG处理后的卵裂率、囊胚率和细胞数。本研究证实甘氨酸对猪卵母细胞TG诱导的ERS具有较好的调控效果。(3)探讨了甘氨酸改善ERS的可能途径。基于上述研究结果,我们锁定了钙通道蛋白IP3R1,比较了IP3R1特异性抑制剂光溜海绵素C(Xestospongin C,Xe C)和甘氨酸对ERS的改善效果。结果显示,添加甘氨酸或Xe C均可改善TG诱导的卵丘细胞扩散和第一极体排出率低下的现象,并逆转TG对卵母细胞中ER水平和Ca2+水平的影响,且甘氨酸组和Xe C组间的试验结果无显著差异。PA后早期胚胎发育能力检测发现,卵裂率、囊胚率以及细胞数在对照组、Xe C组和甘氨酸组间无显著差异。结果证实,在猪卵母细胞体外成熟过程中甘氨酸与Xe C具有相似作用,通过影响IP3R1的分布与表达调节Ca2+稳态和ER功能。综上所述,甘氨酸可通过影响IP3R1的分布与表达调控钙稳态来改善猪卵母细胞体外成熟过程中由TG诱导的ERS,从而改善卵母细胞质量,提高猪卵母细胞体外成熟能力以及促进早期胚胎发育。
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