缺血性视神经病变视网膜细胞凋亡信号转导初步探讨前言生物物种的繁衍，遗传特性的保持，以及生物个体的发生、发展，机体各部分之间和生物体内、外环境的统一等所有生命活动，都是在细胞信息传递和调控下进行的。换句话说，一切生命现象，实际上都是机体内细胞对胞外信息的传导，并最终在胞内产生特定效应的一系列复杂的信号转导和调控的过程。细胞信息传递和调控是研究生命现象的基础。近年来，很多人注意到由于视神经前端的小血管循环障碍，发生局部缺氧而致组织水肿，眼底可以出现视乳头水肿，过去将这种情况误认为是视乳头炎，或是脑肿瘤所致，现在认识到它是一个独特的疾病，称为缺血性视神经病变（Ischemic Optic Neuropathy，ION）。在缺血性视神经病变中，细胞死亡主要通过凋亡和坏死两种方式，而凋亡可能是神经元死亡的主要类型。细胞凋亡（Apoptosis）是指机体在生理条件下受到刺激后，经过多种途径的信号传递，导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起细胞自杀性死亡的过程，又叫程序性死亡（programmed cell death，PCD）。但在不同环境、不同细胞或不同刺激的情况下，细胞凋亡的途径又是不同的，因而细胞凋亡的信号传导途径具有多样性，这就使凋亡的发生及调控机制非常复杂。随着对凋亡信号系统越来越多的研究，人们认识到凋亡的信号转导过程是不同通路相互交织、各信号分子相互作用的过程，并构成一个错综复杂的信号网络。如果了解一种凋亡诱导剂引起的凋亡信号转导途径，我们可以根据这条途径来调控凋亡的发生。目前研究发现，细胞内Ca²⁺浓度升高是细胞凋亡的始动因素。视神经保护药物是针对不同的视神经损害学说提出的，包括兴奋氨基酸学说、钙通道学说、一氧化氮学说、自由基学说、凋亡基因调控学说等，而神经细胞内钙超载是细胞死亡的最后共同通路。因此，钙通道阻滞剂在视神经保护的研究中具有重要意义。缺血性视神经病变的机制尚未明了，但许多证据认为细胞内钙离子超负荷及自由基大量生成是造成缺血性视神经病变的重要原因。缺血性视神经病变引起细胞内Ca²⁺超载激活结构型NOS（包括nNOS和内皮型NOS）。钙离子通道阻制剂可以直接阻断神经节细胞的钙离子通道，并可以改善视神经的血流灌注，从而阻断缺血所诱发的细胞凋亡。全身使用钙离子拮抗剂可以缓解缺血性视神经病变病人病情的进展，这一结果提示钙离子拮抗剂对临床上治疗缺血性视神经病变有潜在作用，许多研究资料支持这一假说。基于此思路，我们对钙离子通道细胞凋亡过程中的信号转导及调控机制作一初步探讨。材料与方法一、动物来源及准备实验动物WISTER大鼠，雌雄不限，体重为170-200克，系清洁级动物。由中国医科大学实验动物中心提供。二、方法（一）缺血性视神经病变动物模型的制作大鼠用2.5％乌拉坦腹腔麻醉后，美多丽-P散瞳，由尾静脉注射孟加拉玫瑰红，用激光连续照射视盘20秒钟用于实验1、视网膜光学、电子显微镜切片观察HE染色：将大鼠在不同时间段分别用腹腔注射过量麻药处死，即刻摘除眼球。4％多聚甲醛固定30min。70％、80％、90％、95％、100％Ⅰ、100％Ⅱ酒精各2min脱水。二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2min透明。56石蜡浸蜡两次共10min，石蜡包埋。将包埋好的眼球标本沿视神经矢状轴前后方位视网膜全层切片，切片厚度5微米。苏木素伊红染色，中性树胶封片。将大鼠在不同时间段分别用腹腔注射过量麻药处死，即刻摘除眼球后，在显微镜下取出视网膜放于2.5％戊二醛溶液内固定。用于电镜标本制作。2、定量观察视网膜内层厚度测量：应用美国Image Proplus专业图像分析软件系统测量距视盘边缘100μm长度内视网膜内层厚度（指视网膜内界膜到外丛状层内缘的距离）。每只眼球取3张切片进行分析。神经节细胞计数：同样方法在视网膜切片上计数100微米内神经节细胞层神经节细胞数量，每只眼球取3张切片进行分析。3、视网膜打墨观察正常和和孟加拉玫瑰红诱导激光30分钟后分别于左心室注入墨汁5毫升，此时大鼠心脏、全身、耳部及眼球迅速变为黑色，迅速处死动物并取出眼球，剪除角膜，去除晶体、玻璃体，置于显微镜下观察并照相。4、闪光VEP观察大鼠经激光后当天、1天、3天、6天、13天及59天观察，右眼为实验眼，左眼为对照眼。麻醉后散瞳，未检查眼用不透光黑布遮盖避光。刺激器采用全视野闪光刺激。分别安放记录电极、参考电极和接地电极于枕骨粗隆突上、前额、耳部，记录电极和参考电极为银-氯化银针刺电极，电极线固定。操作时白光闪耀，大鼠置于闪光刺激器内，刺激频率为2HZ，1.95-cds／m2，每个时间点至少测量3次，分别记录。（二）缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡过程中细胞内Ca²⁺变化及Ver的阻断作用1、免疫组织化学检测视网膜神经节细胞凋亡4％多聚甲醛灌注固定，取双侧眼球剪去角膜，弃去晶状体及玻璃体，眼杯在相同的固定液中后固定4h，30％蔗糖磷酸缓冲液中浸泡过夜，OCT包埋，恒冷箱切片机切片，片厚15μm。切片经10％羊血清预处理30分钟后入兔抗血清（1∶1000）中4℃冰箱过夜，羊抗兔IgG（1：200）37℃1h，ABC复合物室温1h，DAB呈色（0.05％DAB，0.01％H₂O₂）。反应后的切片经脱水透明，中性树胶封片，光镜观察并照相。2、Fluo-3／AM负载技术检测缺血性视神经病变不同时间视网膜细胞内Ca²⁺含量。取缺血性视神经病病变及正常大鼠视网膜，设立对照组及1、3、5、7天实验组及1、3、5、7天Ver阻断组，采用Fluo-3／AM负载技术，日立F-3000型荧光双波长分光光度计测定，结果由日立F-3000钙测定系统定量软件自动求出。（三）缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡过程中PKC-β含量及活性变化的检测1、免疫组织化学检测视网膜内PKC的含量4％多聚甲醛灌注固定，取双侧眼球剪去角膜，弃去晶状体及玻璃体，眼杯在相同的固定液中后固定4h，30％蔗糖磷酸缓冲液中浸泡过夜，OCT包埋，恒冷箱切片机切片，片厚15μm。切片经10％羊血清预处理30分钟后入兔抗PKC血清（1∶1000）中4℃冰箱过夜，羊抗兔IgG（1∶200）37℃1h，ABC复合物室温1h，DAB呈色（0.05％DAB，0.01％H₂O₂）。反应后的切片经脱水透明，中性树胶封片，光镜观察并照相。2、Westenblot的方法检测缺血性视神经病变视网膜细胞内不同时间PKC-β含量及活性。取缺血性视神经病病变及正常大鼠视网膜，设立对照组、1、3、5、7天实验组及1、3、5、7天Ver阻断组，用westenblot的方法检测PKC-β含量及活性。（四）缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡中c-fos mMRNA因子的表达取缺血性视神经病病变及正常大鼠视网膜，设立对照组及15分、30分、1h、2h、4h、6h、12h提取RNA，用RT-PCR的方法检测c-fos基因mRNA的表达。结果1、缺血性视神经病变动物模型的制作单纯用孟加拉玫瑰红尾部注射和单纯激光的方法均不能产生视网膜缺血。用孟加拉玫瑰红诱导后，用激光的方法可以成功制作缺血性视神经病变模型，并在闪光VEP、视网膜血液供应、光镜、电镜等方面都有相应的改变。且能量为75毫瓦、照射时间为20s效果最为理想。2、缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡中细胞内钙变化及Ver的阻断作用缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡后细胞内钙明显增高，用Ver阻断剂后细胞内钙明显下降，但仍比正常细胞内钙高，在使用Ver后视网膜水肿明显减轻，且差异具有显著性，(P＜0.05=。3、缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡中PKC-β含量及活性变化的检测缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡后，PKC-β活性较对照组明显升高，用Ver阻断剂后，PKC-β活性降低，但仍比正常活性高。4、缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡中c-fos mMRNA因子的表达c-fos mRNA在正常情况下含量很少，缺血15分钟后开始增多，1h达到高峰，然后逐渐减少，12h基本恢复正常。结论1、用孟加拉玫瑰红诱导后，用激光的方法可以成功制作缺血性视神经病变模型。2、缺血的程度与激光照射时间及能量相关。3、缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡过程中，细胞内Ca²⁺浓度升高，用Ver阻断剂后细胞内Ca²⁺明显下降，但仍比正常细胞内钙高，Ca²⁺的稳态失调可能是细胞凋亡的启动信号。4、缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡过程中，PKC-β参与了凋亡过程中信号传导途径，并与细胞内Ca²⁺钙的浓度高低相关。5、缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡过程中，c-fos基因的表达类型属于快速一过性表达。