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Sall4(Spalt-like transcription factor 4)是一种C2H2型锌指蛋白转录因子,其对干细胞系的建立和多能性维持有重要作用。Sall4可以在组织中广泛表达,它有多个可变剪切体,在人和小鼠上有SALL4A和SALL4B两个剪切体(Ma et al.,2006;Rao et al.,2010),SALL4B与SALL4A相比缺失了第二外显子的大部分区域,其功能对多能性的维持起着非常重要的作用。Otx2(Orthodenticle homeobox 2)属于Otx转录因子超家族成员(Finkelstein et al.,1990;Simeone et al.,1992;Simeone et al.,1993),该家族成员在感光细胞和延髓脑区的早期发育中起到了重要作用(Matsui et al.,1989;Gronwald et al.,1988)。有文献报道,Otx2蛋白参与调控小鼠初始态多能干细胞与激发态多能干细胞之间的转变过程,该调控对平衡小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)的自我更新和多向分化潜能起着至关重要的作用(Dario et al.,2012)。我们的研究旨在克隆猪SALL4基因的两种剪切体SALL4A和SALL4B,研究SALL4不同剪切体对OTX2基因的调控关系。本研究证明了猪SALL4不同剪切体的存在,还证明了SALL4对OTX2基因的直接调控的关系,丰富了猪多能干细胞调控网络信息,为研究猪干细胞多能性和重编程调控机制奠定基础。本研究主要获得的结果如下:1.猪SALL4基因可变剪切体的克隆和功能验证从猪iPS细胞中克隆长度为3153 bp的SALL4A和1851 bp的SALL4B,构建pEGFP-SALL4A和pEGFP-SALL4B报告载体,并用Western blot鉴定融合蛋白的表达。将pEGFP-SALL4A和pEGFP-SALL4B报告载体转入293T细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达定位情况。用RT-PCR检测猪不同组织(包括脑、脊、皮肤、心脏、肌肉、脾、肾、胸腺、脂肪、睾丸、卵巢、肝脏)和细胞(包括PEF、iPS-j、iPS-g和iPS-w)中SALL4的表达,结果表明猪SALL4基因仅在睾丸、卵巢和iPS中高表达,证明猪SALL4具有组织表达特异性。采用免疫荧光染色方法对猪iPS和分化的iPS细胞进行检测,结果显示猪iPS中SALL4有较高的表达,而分化的细胞中SALL4表达很少或几乎没有。将iPS细胞用视黄酸(RA)处理,检测诱导分化不同天数SALL4A、SALL4B、OCT4、SOX2和ESRRB的表达变化,实验结果表明随着时间的增加SALL4和其他几个转录因子的表达量都有不同程度的降低。在猪iPS细胞中超表达SALL4A、SALL4B和SALL4A/B,能够上调其他多能转录因子的表达;而敲低SALL4的表达,会导致其他转录因子表达水平降低。这表明SALL4与其他多能转录因子一样在多能性的维持上起着重要作用,其中SALL4B起主要作用。2.猪SALL4启动子的克隆隆、、、调控元件的筛选和功能验证调控元件的筛选和功能验证从猪肾基因组中克隆长度为2123 bp的SALL4启动子片段,构建pE2.1和p L2.1报告载体。将报告载体分别转染P19、293T、CHO、Hela和PK15细胞,结果表明猪SALL4启动子在P19、293T、CHO和Hela等细胞中可以被激活,在PK15细胞中不被激活,表明猪SALL4启动子具有组织特异性调控。对2123 bp启动子区域进行生物信息学分析,预测结果显示该序列上有OTX2、OCT4、SOX2、KLF4、ESRRA、ESRRB等转录因子的结合位点。将SALL4启动子与这些转录因子共转,利用双萤光素酶实验检测,结果表明OTX2、OCT4、SOX2、c-Myc、ESRRA、ESRRB、SMAD2、SMAD3等因子对SALL4启动子都有不同程度的上调作用。为了研究SALL4启动子的关键调控区,分别克隆了不同长度缺失的SALL4启动子片段(1901 bp、1071 bp、532 bp和176 bp),将其分别连接到pGL3-Basic上构建报告载体。将这些载体分别转染293T细胞,检测荧光素酶活性,结果确定了猪SALL4启动子在-368 bp至-851 bp区域内存在核心调控区。3.猪SALL4与OTX2相互作用关系的的研究研究通过预测发现猪SALL4启动子上有OTX2的结合位点。在猪iPS细胞中超标达OTX2,然后进行实时定量RT-PCR和WB检测,结果表明SALL4A和SALL4B的表达水平显著降低;相反,敲低内源OTX2的表达,SALL4A和SALL4B的表达都有一定程度的上调,说明OTX2对SALL4有负调控作用。将SALL4不同长度的启动子与pcDNA-OTX2共转,利用双萤光素酶报告系统检测SALL4启动子活性,结果显示OTX2在SALL4启动子-368 bp到-851 bp区域内存在抑制调控位点。为了证明SALL4对OTX2的调控作用,我们克隆了不同长度OTX2启动子片段(O-1865 bp,O-1450 bp,O-1038 bp,O-203 bp),将不同长度的OTX2启动子与pMX-SALL4共转,利用双萤光素酶报告系统检测OTX2启动子活性,结果显示OTX2启动子-1327 bp到-915 bp位置存在SALL4的负调控位点。本实验室前期的研究工作,表明在猪iPS细胞中超表达OTX2,会导致iPS细胞克隆形态变松散,AP染色不均匀,AP阳性克隆数显著降低。我们在OTX2+的iPS细胞中超表达SALL4A或SALL4B,可以使iPS克隆形态好转,提高AP阳性克隆率,证明SALL4对OTX2具有负调控作用。