研究背景和目的:高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)是存在于真核生物细胞内的一类非组蛋白染色体结合蛋白,参与基因转录、DNA修复、V(D)J重组、细胞外信号转导、核小体的构建、细胞的增殖、分化、迁移及凋亡,肿瘤的发生、生长、转移和浸润等。HMGB1含有215个氨基酸残基,高度保守。HMGB1由三个不同的结构域组成:两个HMG box结构域以及一个由30个氨基酸组成的C末端。HMGB1能与DNA结合,通过调节染色质架构(染色体中由非组蛋白构成的结构支架)进而调控翻译、修复和重组。在细胞受到刺激、细胞死亡、凋亡,组织缺氧及缺血再灌注时,HMGB1可以被释放到细胞外,参与炎症、细胞迁移、分化和血管发生。许多研究显示:HMGB1可参与肿瘤的发生和发展,其可能的机制包括HMGB1的高表达引起某些基因表达失调,从而导致细胞具有肿瘤表型;此外,HMGB1的高表达还可使获得肿瘤表型的细胞免于凋亡,最终导致肿瘤的发生。在结肠癌、前列腺癌、肺癌及食道癌等多种肿瘤组织中均发现了HMGB1的高表达,同时也伴随有晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)的表达。RAGE是HMGB1的受体,通过JAK/STAT信号转导通路对HMGB1的表达产生调节效应。胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是颅内最常见的恶性肿瘤,具有很高的致死率,其主要原因是由于肿瘤细胞的高浸润性和转移性。根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)所定标准,胶质瘤的病理分型可分为四级:I级是毛细胞型星形细胞瘤、II级是弥漫性星形细胞瘤、III级为间变型星形细胞瘤、IV级为多形性GBM,其中I级和II级为低级别,属良性肿瘤,III级和IV级为高级别,属恶性肿瘤。近些年来,针对胶质瘤的治疗虽然在手术、放化疗方面取得了很大进步,但由于肿瘤细胞的侵袭性、血脑屏障的不通透性以及对肿瘤细胞来源和其生长机制的不明确性,大大局限了治疗的有效性。有研究通过检测人脑胶质瘤组织中HMGB1基因的表达水平,探讨其与胶质瘤发生发展的关系,结果显示:HMGB1 m RNA的表达水平在胶质瘤组明显高于对照组,但在低级别组与高级别组中的表达水平无显著差异。也有研究显示:高表达HMGB1的肿瘤细胞或者坏死的肿瘤细胞可将HMGB1释放到细胞外,促使周围肿瘤细胞的增殖,同时诱导小血管的再生,从而促使肿瘤的不断生长;给予HMGB1或RAGE抑制剂,可抑制肿瘤细胞的增殖。目前对于HMGB1在人胶质瘤组织中的表达与定位及其作用尚不完全清楚,如:HMGB1在各级胶质瘤中的表达程度是否相同;表达在胞核还是胞浆;表达在何种类型细胞中;HMGB1是否影响胶质瘤细胞的增殖、存活、凋亡和自噬,以及具体的机制是什么等问题尚待解决。因此,本课题的研究目的是阐明HMGB1在各级胶质瘤组织中的表达程度,细胞定位与表达的细胞类型,初步探讨HMBG1对胶质瘤细胞线粒体的形态、细胞的凋亡与自噬的影响,为胶质瘤的临床治疗提供理论依据。研究材料:选自中国人民解放军第153中心医院病理科提供的各级胶质瘤组织的石蜡标本,这些标本均来自该院神经外科胶质瘤患者手术切除的组织,其中低级别标本(I~Ⅱ)12例,高级别标本(Ⅲ~Ⅳ)15例。细胞实验所用到的细胞系为U87-MG胶质瘤细胞系,购置于中国科学院细胞库。研究方法:1.免疫组化单标记或双标记染色,观察HMGB1在各级别胶质瘤中的表达程度、细胞定位及表达的细胞类型。2.质粒的构建及抽提:通过上海生工生物公司合成过表达HMGB1的质粒,HMGB1连接在p EGFP-C1载体上(HMGB1与EGFP融合表达),对照载体是p EGFP-C1空载体。使用BIOMIGA无内毒质粒DNA小量提取试剂盒抽提质粒。3.质粒转染:应用Simple-Fect Transfection Reagent转染试剂盒将过表达HMGB1的质粒和空对照质粒转染U87-MG细胞,1)提取细胞蛋白,进行Western Blotting(WB)实验,观察构建的质粒能否过表达HMGB1;2)用细胞免疫荧光法观察过表达HMGB1是否影响线粒体的形态、细胞的凋亡或自噬。4.用促炎因子LPS&IFN-γ联合刺激U87-MG细胞,提取蛋白,进行WB实验,检测炎症是否影响HMGB1的表达。5.统计学分析:数据采用SPSS17.0或Origin70软件分析,具体分析方法为卡方检验以及单因素方差分析(One-Way ANOVA),数据采用均数±标准误(Mean±SE)表示。结果:1.高级别胶质瘤标本中,HMGB1高表达的标本比例显著高于低级别标本中的高表达比例(χ2=7.56,P=0.01);对于HMGB1中等程度表达的标本比例(χ2=1.17,P=0.18)以及低表达的标本比例(χ2=1.93,P=0.13),两个级别间未出现显著差异。2.HMGB1的阳性信号主要定位在胞核,偶见在一些细胞的胞浆中也有HMGB1的阳性信号。在低级别和高级别组织中,HMGB1在胞核中表达的细胞比例均显著高于在胞浆中表达的细胞比例(低级别P=0.00797;高级别P=0.00130);而将低级别和高级别在胞核与胞浆的相应数据进行对比,均未检测到有显著差异(胞核P=0.79254;胞浆P=0.44251)。此外,随着胶质瘤级别的增加,HMGB1的表达出现不规则形态或分页形态,而在低级别胶质瘤组织中,HMGB1的表达为均匀的圆形或椭圆形。3.各级胶质瘤组织中,在胶质瘤相关星形胶质细胞(GFAP标记)、胶质瘤相关干细胞(Nestin标记)、小胶质细胞(Iba1标记)、血管内皮样细胞以及神经元样细胞中均有HMGB1的阳性表达。4.高级别胶质瘤中先天免疫细胞小胶质细胞表现出明显的活化状态(突起回缩,胞体增大和变圆),此外,炎性因子IL-6的表达明显增加(P=0.0178)。采用促炎因子LPS和IFN-γ联合刺激U87-MG细胞,HMGB1的蛋白表达量增加。5.HMGB1在U87-MG中,主要表达在胞核,核仁分布更为明显。6.HMGB1过表达导致U87-MG细胞中线粒体发生断裂;未发现HMGB1过表达对LC3B以及Caspase3表达的影响。结论:1.随着胶质瘤级别的增加,HMGB1的表达增加;HMGB1主要表达在胞核,并且随着级别增加,HMGB1出现多形性分布;HMGB1在胶质细胞、免疫细胞、肿瘤干细胞、血管样细胞以及神经元样细胞中均有表达。2.在胶质瘤细胞中,HMGB1在炎症刺激下表达增加;HMGB1主要定位在胞核中,有较明显的核仁定位。过表达HMGB1导致胶质瘤细胞线粒体断裂。