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研究背景在全球,虽然胃癌的发生率和死亡率在过去的七十年来总体呈下降趋势,但仍是世界上第四位最常见的癌症,其死亡率居于所有癌症导致死亡的第二位。胃癌在亚洲是最常见的肿瘤之一。早期胃癌的患者接受手术治疗后,一部分患者仍需接受化疗以控制局部复发或远处转移,而进展期或者弥散型的胃癌患者更需要化学治疗,但是目前在实际临床工作中还没有公认较好的胃癌化疗方案,因此在胃癌的化疗中特别需要新的无毒高效的药物和公认的标准化疗方案。全反式维甲酸(以下简称ATRA)是治疗急性早幼粒细胞白血病的临床首选药物。但由于维甲酸综合征和维甲酸抵抗等不利作用的存在,使ATRA在临床没有得到广泛应用,也促使此领域的研究者们致力于通过改变ATRA结构,以获得药效更强且毒性更低的ATRA衍生物。本校药学院合成了一系列ATRA衍生物,经过筛选发现其中的4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(以下简称ATPR)能对多种肿瘤发挥较好的抗肿瘤作用,但现在还不明确ATPR对人低分化胃腺癌细胞株BGC-823是否可以发挥抗肿瘤作用。现在主要认为ATRA是通过其受体发挥作用的,即维甲酸受体和视黄醇类X受体,ATRA与受体结合后,通过调节靶基因的转录,从而发挥诱导分化和抑制增殖等作用,目前尚不清楚ATPR是否是通过影响BGC-823细胞的维甲酸受体和视黄醇类X受体表达水平而作用于下游基因。在肿瘤侵袭和转移的过程中,肿瘤细胞之间的粘附性和细胞运动能力的变化是重要因素之一。紧密连接是体内细胞之间连接系统的组成之一,紧密连接蛋白如Occludin和ZO-1等的结构和功能若发生异常,则细胞之间粘附性下降,有利于肿瘤细胞侵袭和转移。在细胞的运动方面,MLCⅡ磷酸化可激活肌球蛋白活性而触发肌动球蛋白间的滑行,导致细胞的迁移,而MLCK,ROCK和MLCP这三个酶可以调节MLCⅡ磷酸化而控制细胞的运动。目前还不明确ATPR是否可以通过影响BGC-823细胞之间的粘附性和细胞运动能力来抑制细胞的迁移。此外近年来肥胖,糖尿病与肿瘤之间的关系备受关注,肥胖或糖尿病患者较体重正常者或非糖尿病者更易罹患某些肿瘤,而且预后更差。而肥胖或糖尿病患者体内高胰岛素血症可能是主要原因。目前尚不清楚ATPR是否可以抑制胰岛素对肿瘤的促进作用。由于ATPR对胃癌细胞生物学行为的影响还未全面了解,相关机制还存在空白,也不清楚ATPR能否影响胰岛素对胃癌细胞的作用。因此本课题以人低分化胃腺癌细胞株BGC-823为研究对象,探讨ATPR对BGC-823的作用及其可能的分子机制,为ATPR能够今后用于胃癌的临床治疗奠定理论基础。目的通过本课题研究ATPR对人低分化胃腺癌细胞株BGC-823增殖,分化和迁移等生物学行为的影响,并探讨其中可能的作用机制;以明确ATPR对人胃癌细胞BGC-823的抗肿瘤作用,并与ATRA的作用进行比较,揭示ATPR发挥作用的可能机制。方法1.采用倒置相差显微镜下观察细胞变化,MTT法检测细胞活力并明确最佳作用时间和半数抑制浓度,结合平板克隆法观察ATPR对肿瘤细胞体外克隆形成能力的影响以明确ATPR对BGC-823细胞增殖能力的影响。2.采用倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,PI单染后在流式细胞仪中检测细胞周期分布,结合检测ALP和LDH酶活性以明确ATPR对BGC-823细胞分化能力的影响。3.采用划痕实验观察不同浓度ATPR作用不同时间后对BGC-823细胞迁移能力的影响。4.ATPR处理BGC-823细胞后,采用Western blots法检测RARs,RXRs,MLCK,p MYPT1/MYPT1,p MLC/MLC,Occludin,ZO-1等蛋白水平的变化;采用实时定量逆转录PCR检测MLCK,ROCK1,ROCK2等基因的m RNA水平改变;采用免疫荧光细胞化学法观察Occludin,ZO-1在细胞内位置的变化。5.采用划痕实验观察特异性抑制剂ML-7和H-1152对BGC-823细胞的作用,并用Western blots法检测其对MLCK,p MYPT1,MYPT1蛋白水平的变化。6.采用MTT,倒置相差显微镜下观察和划痕实验确定胰岛素对BGC-823细胞的影响;在划痕实验中联合ATPR观察其对胰岛素作用的影响,并用Western blots法检测MLCK,p MYPT1,MYPT1蛋白水平的变化。结果1.在ATPR对BGC-823细胞增殖能力影响的实验中,三种方法的实验结果均显示ATPR比ATRA能更有效的抑制BGC-823细胞的增殖能力,即镜下观察到在相同作用浓度下,ATPR作用组比ATRA作用组细胞数目更少;MTT结果显示ATPR刺激BGC-823后吸光度值明显下降,且ATPR对BGC-823的抑制作用存在时间依赖性和浓度依赖性,ATPR的IC50=27.86μmol/l,ATRA的IC50=49.99μmol/l;25μmol/l的ATPR或ATRA处理细胞48 h后进行平板克隆实验,观察到药物作用组的体外克隆形成能力下降即细胞的增殖能力和细胞贴壁依赖性下降。2.在观察ATPR对BGC-823细胞分化能力影响的实验中,镜下显示ATPR作用后出现分化细胞的形态改变;25μmol/l的ATPR或ATRA处理细胞48 h后,流式细胞仪检测到其细胞周期阻滞在G0-G1期而S期下降;20μmol/l到50μmol/l不同浓度的ATPR或ATRA处理细胞48 h后,其ALP和LDH酶活性不同程度下降,这些实验结果中均显示ATPR比ATRA能更有效的诱导BGC-823细胞的分化能力。3.划痕实验结果显示10μmol/l ATPR处理48 h后,比同样浓度作用相同时间的ATRA能更有效的抑制BGC-823细胞的迁移能力。4.在机制的探讨中,首先Western blots法观察到ATPR作用后BGC-823细胞的RARα,RARβ和RXRβ蛋白表达水平均下降;然后q RT-PCR结果显示ATPR作用于BGC-823后MLCK,ROCK1和ROCK2的m RNA表达水平下降,Westernblots结果显示MLCK,p-MYPT1,p-MLC蛋白表达水平下降;之后我们采用MLCK的特异性抑制剂ML-7或ROCK的特异性抑制剂H-1152作用于细胞,观察到二者对BGC-823细胞的迁移存在抑制作用且能下调MLCK或p-MYPT1蛋白的表达,进一步验证了ATPR可能通过抑制MLCK和ROCK活性而抑制BGC-823细胞的迁移能力;另一方面ATPR刺激BGC-823后紧密连接相关蛋白Occludin和ZO-1蛋白表达水平几乎没有改变,但免疫荧光细胞化学术显示Occludin和ZO-1发生明显的向细胞膜表面移位。5.在胰岛素对BGC-823细胞作用的实验中,MTT结果发现0.5 ng/ml胰岛素处理24 h对肿瘤细胞的增殖几乎没有影响,而10 ng/ml到100ng/ml浓度的胰岛素对BGC-823细胞的增殖有促进作用,镜下观察细胞发现胰岛素作用后细胞出现明显的伪足而且细胞运动力增强,划痕实验结果显示0.5 ng/ml胰岛素就增强了BGC-823细胞的迁移能力,而ATPR可以逆转胰岛素对BGC-823细胞迁移能力的促进作用。结论1.新型全反式维甲酸衍生物ATPR对人低分化胃腺癌细胞BGC-823有抑制增殖,诱导分化,降低迁移的抗肿瘤作用;2.同等浓度,同等作用时间的条件下,ATPR比ATRA更有效的抑制BGC-823增殖,诱导其分化,降低其迁移能力;3.ATPR可以通过降低BGC-823细胞的运动能力和促进细胞之间粘附力以抑制肿瘤细胞的迁移能力;4.ATPR可能是通过维甲酸受体-MLCK/ROCK-p MLC信号通路来调节BGC-823细胞的生物学活性;5.胰岛素能够刺激BGC-823细胞的增殖和迁移能力,而ATPR能够逆转胰岛素的促迁移作用,并可能是通过抑制MLCK的活性来降低胰岛素的促进作用。