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目的:利用Col2a1-Cre ERT2;Ihhfl/fl基因工程小鼠所培育的未成熟的小鼠的肋软骨细胞,使用周期性动态压缩应力(Flexcell-5000施加正弦波、0.5Hz、5k Pa、1h/d压缩应力)的方法探讨条件性敲除Ihh基因后的软骨细胞立体培养的力学生物学特性。方法:1.基因工程小鼠(Col2a1-Cre ERT2;Ihhfl/fl和Ihhfl/fl)的培育及其基因鉴定。2.取刚出生的基因工程小鼠(携带Ihhfl/fl纯合基因并且具有Col2a1-Cre ERT2基因)40只。随机的分为实验组和对照组,实验组基因小鼠给予腹腔连续注射3天TM(Tamoxifen),对照组基因小鼠给予腹腔连续注射3天等量植物油,待第6天时取小鼠肋软骨,急性消化肋软骨细胞作为本实验的细胞来源。3.用实时荧光定量PCR技术来检测Ihh基因相对表达量,计算Ihh基因的敲除率。4.将实验组与对照组急性消化分离的细胞以2×105/ml的密度混于1.5%的海藻酸钠凝胶中,利用模型制成海藻酸钠细胞盘。实验组与对照组各自分为两组:其中一组海藻酸钠细胞盘用Flexcell-5000基底加载系统施加动态压缩应力(正弦波、0.5Hz、5k Pa、1h/d)7、14、21天;另一组海藻酸钠细胞盘静态培养7、14、21天。5.分别在7、14、21天时在倒置显微镜下观察各组软骨细胞的生长状况。6.通过RT-PCR技术测定同一时间点的实验组和对照组内细胞盘的Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、蛋白多糖(AGG)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)m RNA的相对表达量。7.运用半无限体细胞力学模型与微管吸吮技术相结合来测定各组内不同时间点的细胞力学特性。结果:1.通过RT-PCR检测Ihh基因相对表达量发现:实验组基因小鼠在腹腔注射TM(Tamoxifen)后与对照组相比其Ihh基因相对表达量降低(P<0.01)。对Ihh信号通路的下游基因Gli-1的相对表达量进行检测发现:实验组Gli-1基因表达降低(P<0.01)(图1)。敲除效率约为64%。2.同一时间点,压缩刺激可以促进软骨细胞在海藻酸钠凝胶中的增殖,倒置显微镜观察细胞盘发现:实验组、对照组内压缩细胞盘的细胞密度随着压缩刺激天数的增长而增加,其密度明显高于同组内静态培养组;实验组(基因敲除)与对照组(未敲除)相比:敲除Ihh后的软骨细胞盘与未敲除Ihh的软骨细胞盘中的细胞密度相差不明显。3.RT-PCR检测:(1)实验组(基因敲除)与对照组(未敲除)立体培养细胞盘相比、压缩细胞盘相比:7天时,实验组的AGG、Col II相对表达量增高(P<0.05);实验组内、对照组内的压缩细胞盘与立体培养细胞盘相比:压缩7天AGG、Col II相对表达量增高(P<0.05);各组内不同时间点AGG、Col II相对表达量对比:压缩组7天表达量高于14天、21天(P<0.05);(2)实验组(基因敲除)与对照组(未敲除)中立体培养细胞盘相比、压缩细胞盘相比:实验组的内各时间点ColⅩ、MMP-13的相对表达量较对照组内各时间点的相对表达量均降低,其中7天、21天实验组的表达水平降低明显(P<0.05);实验组内、对照组内的压缩细胞盘与立体培养细胞盘相比:压缩14天时ColⅩ、MMP-13的相对表达量增高(P<0.05);各组内不同时间点对比:压缩组14天ColⅩ、MMP-13的相对表达量高于7天、21天(P<0.05)。4.各组内细胞瞬时模量(E0)、平衡模量(E∞)、表观黏性(μ)随着培养时间的增加而降低,其中实验组、对照组内压缩21天的E0、E∞、μ明显低于同组内压缩7、14天(P<0.05),7天与14天之间无统计学差异;实验组与对照组相比较,在同一时间点实验组立体培养软骨细胞、动态压缩的软骨细胞的E0、E∞、μ均大于对照组,其中实验组内压缩21天的E0、E∞明显高于对照组内压缩21天(P<0.05);实验组内与对照组内同一时间点的动态压缩软骨细胞的E0、E∞、μ均大于立体培养软骨细胞的E0、E∞、μ,其中实验组内压缩7天的软骨细胞的E0、E∞明显大于立体培养7天的软骨细胞的E0、E∞(P<0.05)。结论:海藻酸钠立体培养的条件性敲除Ihh基因的小鼠肋软骨细胞在生理性动态压缩刺激7天时可以有效的提高ColⅡ和AGG的表达,抑制ColⅩ和MMP-13的表达,可以一定程度上改善软骨细胞的力学性能,然而压缩天数越长软骨细胞所分泌的基质就越少、软骨细胞力学特性也就随之减弱。