肿瘤的侵袭与转移中基底膜或细胞外基质组成成分降解是肿瘤侵袭与转移的关键步骤，其中基质金属蛋白酶(MMPs)家族有重要的作用。该家族的重要成员MMP-9在肿瘤的生长、侵袭与转移以及血管生成中起重要作用，是促进肿瘤生长的重要因素；TIMP-1是MMP-9的特异性抑制剂，TIMP-1的下调表达与肿瘤的侵袭性增加有关，而过表达与肿瘤生长和转移的减少相关，但是近来另有研究表明TIMPs也可促进肿瘤生长。 研究假设：不同来源TIMP-1对肿瘤细胞生物学行为可能有不同的影响。即内源性表达TIMP-1来源于肿瘤细胞本身或外源性表达来源于肿瘤细胞以外的第三方细胞(基质细胞或其它体细胞)，有可能是决定TIMP-1对肿瘤生物学行为影响不同的原因之一。 研究目的：研究MMP-9和TIMP-1在人类大肠癌中表达的临床病理意义，从临床与病理联系中验证研究假设；利用天然高表达MMP-9而不表达TIMP-1的大肠癌细胞系TCH-8908，分别建立内源性TIMP-1表达和外源性TIMP-1表达大肠癌肿瘤细胞模型，观察不同来源TIMP-1表达对大肠癌侵袭和转移特性的影响，利用肿瘤模型中细胞生物学特性差异验证研究假设。 研究分以下五部分： 第一部分：MMP-9和TIMP-1在人类大肠癌中表达的临床病理意义研究。方法：用免疫组化法检测70例大肠癌手术标本中MMP-9和TIMP-1表达情况，同时回顾临床病理特征，对MMP-9、TIMP-1的表达情况和临床病理联系进行研究。结果：MMP-9的表达可作为判断大肠癌侵袭转移和预后的的有效指标。 第二部分：TIMP-1基因的克隆与鉴定。方法：从表达TIMP-1的大肠癌 天津医科大学博士学位论文细胞系Lovo细胞的RNA中采用Rq’- PCR技术扩增TIMP一1基因cDNA，采用亚克隆技术将扩增的TIMP一1基因构建入pGEM一T载体，并进行相应酶切测序鉴定分析。结果:成功扩增TIMP一1基因，为进一步研究奠定基础。 第三部分:大肠癌TCH一8908内源性TIMP一1基因表达肿瘤模型构建与鉴定。方法:利用克隆出的TIMP一1基因，构建带筛选标记的真核表达载体peDNA一TIMP一1;采用电穿孔技术将peDNA一TIMp一1转移至人大肠癌细胞系TCH一8908中，经筛选获得稳定表达TIMP一1基因的亚细胞系TCH一8908(TIMP一l)，并采用Rl’- PCR及免疫组化方法进行相关鉴定。结果:成功构建内源性稳定表达TIMP一1的TCH一8908人类大肠癌细胞模型TCH一8908(TIMp一1)，为进一步研究细胞内源性TIMp一1表达对TCH一8908细胞生物行为的影响奠定基础。 第四部分:外源性TIMP一1基因表达载体构建与鉴定。方法:利用克隆的TIMP一1基因，构建可用于基因转染的腺病毒载体pAdTIMP一1，经AD一293细胞包装，获得腺病毒AdTIMP一1，并进行相关鉴定;结果:成功构建较高滴度可用于真核细胞TIMP一1基因转染的腺病毒，通过病毒转染构建外源性TIMP一1表达的人类大肠癌模型TCH一8908(AdTIMP一l);为进一步研究细胞外源性Tl州[P一1表达对TCH一8908细胞生物行为的影响奠定基础。 第五部分:不同来源TIMP一1对TCH一8908细胞侵袭与转移特性的影响。方法:检测TCH一8908细胞、TCH一8908(TIMP一1)细胞和TCH一8908(AdTIMP一l)细胞在体外增殖速度、克隆形成、重组基底膜侵袭抑制试验、细胞移动试验和SCID免疫缺陷小鼠移植瘤形成试验进行体内体外研究。结果:不同来源的TIMp一1对TcH一8908的生物学行为有不同影响。 结论:本研究结果初步证实了研究之初提出的假设。通过以上研究，我们可以初步得到以下结论: 当TIMp一1来自肿瘤细胞内部(内源性表达)时，TIMP一1的表达有可能促进肿瘤细胞的生长;当TIMP一1来自肿瘤细胞外其它细胞时(外源性表达)，Tn吐P一1的表达有可能抑制肿瘤细胞的生长;但是无论是内源性还是外源性的 一2- 天津医科大学博士学位论文TIMP一1表达均不影响肿瘤克隆形成能力，肿瘤形成能力不受影响。 内源性T洲P一1的表达有可能促使肿瘤细胞的移动能力增强，但AdTIMP一1腺病毒介导的外源性TIMP一1表达，则不影响肿瘤细胞的移动能力;内、外源性TIMP一l对TCH一8908的侵袭能力有抑制作用，但外源性TIMP一1的抑制作用更大。 内源性TIMP一1的表达，可显着促进肿瘤生长，促进肿瘤转移:外源性TIMP一1的表达，则可显着抑制肿瘤生长，但本次研究不能得出外源性TIMP一1表达可抑制肿瘤转移的结论。 观察TIMP一1对肿瘤细胞生物学行为的影响将有助于了解TIMP一l在大肠癌中的病理意义，为进一步阐明TIMP一1在大肠癌中的作用机制提供理论依据。